转录因子碳水化合物反应元件结合蛋白研究进展

张明捷 陈寒蓓

Yamashita等[1]于2001年发现了一种与碳水化合物反应元件(carbohydrate response element，ChoRE)结合的蛋白质，将其命名为碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate response element binding protein，ChREBP)。ChREBP在哺乳动物的各种组织中广泛表达，在肝脏、脂肪组织、小肠、肌肉和肾等组织中有较高的表达[2]。ChREBP是葡萄糖信号途径中的转录因子，它直接激活多个参与糖酵解和脂肪合成基因的表达，对于调控体内糖、脂肪代谢具有十分重要的作用。

1 ChREBP的分子生物学特性

参与肝脏糖酵解及脂质合成的多种酶受碳水化合物的调控。葡萄糖能够刺激肝脏丙酮酸激酶(liver pyruvate kinase，LPK)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)等糖脂代谢相关酶的基因转录，从而促进葡萄糖转化为脂肪。最初的研究发现，LPK等葡萄糖反应性基因的启动子区存在着由间隔5bp的2个E盒(CAC GGG和CCC GTG)组成的ChoRE，其介导了葡萄糖对靶基因的转录激活作用[3]。2001年，Yamashita等首先分离纯化到与LPK启动子区ChoRE特异性结合的蛋白质，将其命名为ChREBP。

ChREBP属于碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(basic helix-loop-helic/leucine zipper，bHLH-ZIP)转录因子家族，能够识别靶基因中的Ebox序列。大鼠来源的ChREBP蛋白由864个氨基酸残基组成，相对分子质量为946 000。ChREBP蛋白序列在不同类哺乳动物组织中具有高度同源性，人、大鼠和小鼠来源的ChREBP有82%的同源性[4]。ChREBP蛋白包含有多个不同的结构域，主要包含以下结构域[5]：N末端的核定位信号(nuclear localization signal，NLS)、C末端的b/HLH/Zip结构域、富含脯氨酸结构域(proline-rich domain，Pro-rich)和亮氨酸锌指样结构域(leucine-zipper-like domain，Zip-like)。此外，还含有4个与其活性密切相关的磷酸化位点：cAMP依赖蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase，PKA)和AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的磷酸化位点(图1)。

图1 ChREBP结构图[6]

2012年，Herman及其同事发现了一种ChREBP的新型异构体，称为ChREBP-β[7]，作者从1a起始位点翻译产生了全长864个氨基酸的蛋白(ChREBP，更名为ChREBP-α)，而在位于外显子4的下一个起始位点开始，翻译产生包含687个氨基酸的蛋白(ChREBP-β)。葡萄糖刺激ChREBP表达存在前馈机制，葡萄糖首先诱导ChREBP-α的转录，其反式激活ChREBP-β的转录，而后者则是更有效的转录激活因子。这种机制表明ChREBP-α不调节其自身的表达，而是有效地诱导另一种ChREBP同种型的表达。目前尚不清楚ChREBP-α的作用是否限于ChREBP-β，或两种同工型是否与其靶基因的ChoRE相互作用并协同结合。

2 ChREBP表达调控和活性调节

2.1 ChREBP基因转录的表达调节 ChREBP的转录调节作用有赖于Max样蛋白X(Max like protein X，Mlx)的存在。ChREBP必须与Mlx形成异二聚体后，才能与靶基因的ChoRE结合，发挥其转录调节作用[8]。因此，Mlx是ChREBP重要的功能伴侣。Iizuka等[9]研究发现，给予Mlx的显性负突变体，体内能抑制脂肪合成过程酶的表达，从而改善糖尿病小鼠的糖脂代谢。

2.1.1 转录因子肝X受体(liver X receptors，LXR)核受体LXR对ChREBP的基因转录具有激活作用。LXR是脂质合成过程中的重要调节因子，能被固醇所激活，可与维甲酸X受体形成异二聚体，作用于靶基因启动子的RXR/LXR DNA位点，从而调节靶基因的转录。Cha等[10]研究发现LXR激动剂能够上调肝脏ChREBP及其靶基因LPK的表达，提示LXR可通过调节ChREBP来促进肝脏脂质合成，在转录水平直接调控ChREBP的表达。Mitro等[11]研究认为，葡萄糖可以激活LXR的表达，经过高糖处理的HepG细胞内ChREBP mRNA的表达水平可升高1倍，故葡萄糖是LXR的配体。但是Denechaud等[12]发现在LXRα/β联合基因敲除小鼠肝脏，葡萄糖诱导的ChREBP、ACC、FAS基因表达与野生小鼠相比无差异，据此推断，LXR并不是葡萄糖诱导肝脏脂质合成基因表达所必需。

2.1.2 多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)PUFA对CHREBP的转录具有负调节作用。PUFA是肝内糖酵解和脂肪从头合成过程中的抑制剂，抑制糖酵解及脂肪合成相关基因的表达如肝脏丙酮酸激酶(liver pyruvate kinase，LPK)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)，从而PFUA促进合成及储存的脂肪酸氧化降解，是脂肪酸合成及降解的转化调节剂。Dentin等[13]通过体内和体外实验证实PFUA抑制CHREBP的活性，PFUA可加速CHREBP mRNA的降解，并且可改变CHREBP从胞质到核内的转移。

2.1.3 甲状腺激素、内毒素及细胞因子Hashimoto等[14]通过饮食改变和注射甲状腺激素构建甲状腺中毒小鼠模型，发现甲状腺激素可通过TR-β1上调肝脏CHREBP mRNA及蛋白水平的表达。对ChREBP启动子上可能存在的LXR结合位点进行研究发现，LXRE2的作用更为强大。在人类Hepal-6细胞和HepG2细胞中也证实了甲状腺激素可以上调ChREBP mRNA和蛋白的表达水平，此过程由LXR调节，其调节方式与小鼠有很大差异。

Feingold等[15]发现在普通及高糖饮食情况下，内毒素、脂多糖(LPS)均可使肝脏ChREBP的表达下调；此外，酵母多糖和松节油也可下调肝脏ChREBP及其靶基因的表达；TNF-α和IL-1β能降低肝脏中ChREBP的表达。

Chau GC等[16]的最新研究则发现，缺乏哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的小鼠，表现出胰岛β细胞团块减少和胰岛体积缩小。其机制是由于mTOR与ChREBP-Max样蛋白复合物相关联，并抑制了其转录活性。Chau等[16]也证明了mTOR可以通过与ChREBP-Mlx复合物相结合来调节凋亡机制以抑制TXNIP，减少β细胞凋亡及氧化应激，从而保护糖尿病环境中的胰腺β细胞。

2.2 ChREBP的活性调节

2.2.1 ChREBP的磷酸化对其活性的调节ChREBP活性的调节主要发生在DNA结合或转录活性的激活及从细胞质向细胞核的转移两个方面。ChREBP含有的磷酸化位点为Ser196、Ser626、Thr666和Ser568。Ser196位点主要调控ChREBP核质间转移，而Ser626、Thr666和Ser568位点主要参与ChREBP结合DNA活性的调节[2]。蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)对Ser196位点磷酸化作用可使ChREBP停留在细胞质中，而Ser196位点磷酸化的ChREBP经蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)去磷酸化后，进入到细胞核内。Thr666位点被PKA磷酸化后，ChREBP结合DNA的活性消失，而无活性的ChREBP经过PP2A去磷酸化后，结合DNA的活性又被激活。Ser568是AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的特异性磷酸化位点，Ser568的磷酸化导致ChREBP结合DNA活性的丧失。而Ser626位点对调节ChREBP结合DNA的活性中仅起辅助作用。葡萄糖通过旁路代谢产物5-磷酸木酮糖促使细胞质中ChREBP的Ser196位点去磷酸化并进入细胞核内。ChREBP进入细胞核内后，葡萄糖通过核PP2A催化Thr666位点去磷酸化，激活无活性的ChREBP，在Ser196和Thr666去磷酸化后，活性的ChREBP与LPK基因ChoRE序列结合，激活LPK基因转录[17]。

2.2.2 葡萄糖传感组件(glucose-sensing module，GSM)对其活性的调节 Tsatsos等[18]认为葡萄糖对ChREBP的调节并不依赖于PKA的磷酸化作用，而是通过另外的机制促进ChREBP表达。他们发现，低糖和高糖作用并不改变ChREBP的磷酸化水平，ChREBP磷酸化位点突变后，仍能对葡萄糖做出应答。Li等[19]认为葡萄糖对ChREBP的调控受GSM调节。GSM由低糖抑制区(LID)和葡萄糖反应活化保守元件(GRACE)2部分组成；低糖时，LID抑制GRACE的活性，高糖时，GRACE抑制LID的活性，认为GSM以这种方式调节ChREBP对葡萄糖的敏感性。ChREBP-α是全长ChREBP蛋白，而较短的同种型ChREBP-β则缺乏大部分LID，仅作为组成型活性蛋白，其表达与葡萄糖浓度无关[20]。

Dentin等[21]认为葡萄糖的代谢产物导致了ChREBP的活化，利用葡萄糖激酶(GK)敲除小鼠模型证实，GK的催化产物6-磷酸葡萄糖在ChREBP的活化及核内转移中发挥重要作用。

2.2.3 ChREBP的乙酰化对其活性的调节Bricambert等[22]研究认为组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，HAT)的共激活物p300和盐诱导基因 (Salt induced kinase2，SIK2)两者共同作为ChREBP上游调节物以调节ChREBP的活性。ChREBP主要的乙酰化位点为Lys672，其位于ChREBP的DNA结合区域中，将Lys672位点突变后，ChREBP的DNA结合和转录激活活性都会有明显的降低。可以推断ChREBP的乙酰化对其作用于靶基因的启动子是需要的。

2.2.4 肝受体同源物1(LRH-1)对其活性的调节近年来，Oosterveer MH的研究也提出，作为胆固醇代谢和胆汁酸稳态调节剂的LRH-1已经被认为是GK-ChREBP轴的上游调节因子，并作为响应于葡萄糖的肝代谢的新型调节剂[23]。这些发现表明ChREBP活性也可以通过LHR-1激活剂和/或抑制剂进行调节。

3 ChREBP的功能

3.1 ChREBP在肝脏中的功能 在肝脏中，存在许多参与碳水化合物和脂质代谢的关键酶，其转录水平会被高碳水化合物饮食等因素诱导。这些酶包括用于糖酵解的葡萄糖激酶(GK)和丙酮酸激酶(L-PK)，ATP柠檬酸裂解酶，乙酰辅酶A羧化酶(ACC)，脂肪酸合成酶(FAS)和用于脂肪生成的硬脂酰CoA去饱和酶(SCD1)以及用于戊糖磷酸途径的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)(图2)[20]。当体内摄入过多的碳水化合物时，在葡萄糖和胰岛素的作用下，肝脏能通过从头脂肪生成途径将多余的碳水化合物转化为三酰甘油，后者被运送至肝外的脂肪组织中贮存。在葡萄糖调节肝脏糖酵解与脂肪生成的过程中，ChREBP发挥了主要作用。

ChREBP是直接激活LPK的主要转录因子，通过激活LPK的表达，促进肝脏糖酵解。体外利用原代培养的小鼠肝细胞研究表明，过表达ChREBP能够上调其LPK的表达水平；而利用RNA干扰的方法，下调ChREBP的表达则可阻断高浓度葡萄糖诱导的LPK基因的表达上调[1]。染色质免疫共沉淀实验证实，ChREBP能与LPK等靶基因的启动子序列结合[24]。体内研究发现[2]，在正常饮食条件下，ChREBP基因敲除小鼠的LPK表达水平下调、丙酮酸/磷酸烯醇式丙酮酸比率下降、丙酮酸的生成减少、糖酵解明显受抑，同时肝脏的6-磷酸葡萄糖和糖原的含量增多；给予高糖饮食时，ChREBP基因敲除小鼠的肝脏质量约比对照小鼠重40%，推测可能与肝脏糖原的累积增多有关。这些研究结果证实，ChREBP是促使葡萄糖酵解并向脂质及糖原转化的关键转录因子[25-26]。

ChREBP还可以激活ACC和FAS，从而促进肝脏的脂肪酸合成。ACC和FAS基因的启动子区均含有ChoRE元件，介导了ChREBP的结合与转录激活作用。在普通饮食或高糖饮食情况下，ChREBP基因敲除小鼠肝脏中的脂质合成酶，包括ACC、FAS、ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase，ACL)和脂酰CoA去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1)等的mRNA表达水平均较对照小鼠明显降低，导致其肝脏中由葡萄糖转化而来的脂质成分降低大约65%，体内脂肪组织含量相对较低[2]。

图2 ChREBP在控制肝细胞糖酵解及脂肪合成中的作用[21]

3.2 ChREBP在胰岛组织中的功能 ChREBP广泛表达于哺乳动物的各种组织中，但在脂肪合成器官，如肝脏、小肠和白色脂肪组织中有较高的表达。非常有趣，ChREBP在胰岛中也有表达。在胰岛中，葡萄糖不但刺激胰岛素的分泌，而且还是许多细胞事件的重要信号。运用DNA微阵列的方法，许多研究者已经证实在胰岛中葡萄糖应答的基因与在肝脏中的相似。在生成胰岛素的INS-1细胞中过表达ChREBP能够上调其LPK、FAS和ACC1的mRNA水平，但是细胞对于葡萄糖刺激后的胰岛素水平与对照组相比没有明显变化。

Poungvarin等[27]研究发现，ChREBP作为一个转录因子，在高血糖诱导的β细胞糖毒性中起了关键性的作用。无论在体内或是体外，ChREBP均能激活其下游靶基因，包括FAS和硫氧还原蛋白结合蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)，其能导致脂质聚集，活性氧簇(ROS)在胰岛细胞中过度产生，氧化应激增加，胰岛素基因的转录减少和胰岛细胞的凋亡。与非糖尿病患者相比，在糖尿病患者胰岛的β细胞核中，ChREBP的免疫反应增加明显。同时，由于糖尿病病程中长期存在的高血糖和高血脂，通常用作底物和代谢燃料的葡萄糖和游离脂肪酸(FAA)产生细胞毒性作用，从而导致胰岛β细胞凋亡和肾衰竭，这种细胞功能的恶化被称为葡萄糖-脂毒性，其致病机制可能为氧化应激和炎症反应。胰腺外源性表达ChREBP的组成型活性形式时，在小鼠中观察到葡萄糖不耐受和低效的胰岛素分泌。

Chau等人[16]的最新研究也证明了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)可以通过与ChREBP-Mlx复合物相结合以调节凋亡，继而抑制TXNIP的表达，从而保护糖尿病环境中的胰腺β细胞。

3.3 ChREBP在脂肪组织中的功能 ChREBP在脂肪组织中也有较高的表达。He等[28]研究表明，分化的3T3-L1脂肪细胞和大鼠脂肪组织表达ChREBP，胰岛素、葡萄糖和抗糖尿病药物troglitazone上调ChREBP在3T3-L1脂肪细胞的表达，而脂肪酸抑制其表达；禁食后再饲喂高碳水化合物膳食使大鼠脂肪组织ChREBP mRNA水平提高10倍。实验发现在大鼠和猪前体脂肪细胞不表达ChREBP mRNA，分化中期开始表达；低糖条件下，胰岛素对培养的成熟脂肪细胞ChREBP转录表达没有影响，但在高糖培养基，胰岛素明显提高ChREBP和FAS及ACC1 mRNA表达水平；高浓度葡萄糖促进，而地塞米松抑制ChREBP转录表达；TNF-α明显下调ChREBP转录表达，胰岛素对此下调作用没有明显影响。对3T3-L1和原代培养脂肪细胞ChREBP表达的研究初步说明，与肝细胞类似，ChREBP也是脂肪细胞生物学作用的重要调节因子[29]。

Herman等[30]研究发现脂肪组织中的ChREBP在整合脂肪细胞和整个机体代谢功能中起到了很重要的作用，而这种作用是由ChREBP-β亚型的转录调节所介导。脂肪组织中的ChREBP对于葡萄糖的稳态具有有益的作用，其原因是由于其上调脂质的从头合成(de novo lipogenesis，DNL)或是调节脂肪因子的功能。在人类研究中显示，脂肪中的ChREBP表达与胰岛素的敏感性具有直接而强有力的联系，这也提示ChREBP在脂肪中的作用与调节机体的胰岛素功能密切相关。

4 ChREBP与疾病的关系

4.1 ChREBP与代谢综合征的关系 研究发现，脂肪肝与胰岛素抵抗和糖尿病密切相关，是代谢综合征的重要组成部分。鉴于ChREBP具有促进肝脏脂肪合成的作用，推测其与ob/ob小鼠的脂肪肝及胰岛素抵抗密切相关。Dentin等[31]研究发现，在饥饿或饱食情况下，ob/ob小鼠肝脏ChREBP的表达水平均显著升高，并且核内活性形式的ChREBP也显著增加。在饱食情况下，ob/ob小鼠肝脏内ChREBP及SREBP-1c的表达都升高，从而引起脂肪合成增加，最终导致脂肪肝的形成。在饥饿情况下，ob/ob小鼠仅有ChREBP表达的上调，提示在饥饿的情况下，可能仅有ChREBP对ob/ob小鼠肝脏内脂肪合成发挥调控作用。

过多的脂质堆积在肝脏中会损伤肝细胞内的胰岛素信号转导通路，致使肝细胞对胰岛素形成抵抗，而抑制肝细胞内的脂质堆积则可明显改善肝细胞胰岛素抵抗程度。敲除ob/ob小鼠体内的ChREBP基因后小鼠体质量明显下降，同时胰岛素抵抗、脂肪肝及葡萄糖耐受不良等表型都有明显改善[32]。ob/ob小鼠肝细胞内异常表达的糖酵解和脂质合成基因在敲除了ChREBP后得以纠正，提示ChREBP对脂肪合成酶基因的诱导表达起到决定性的作用。将ChREBP基因敲除的小鼠杂交到ob/ob小鼠时，后者获得了类似的保护性表型。这表明在肥胖或脂质堆积的情况下肝脏中ChREBP表达的改变有益于增加胰岛素敏感性。Dentin等[31]研究表明，特异性抑制肝脏ChREBP可以纠正ob/ob小鼠脂肪肝和葡萄糖耐受力的下降，缓解小鼠的肥胖、胰岛素抵抗和代谢综合征症状。在感染ad-shChREBP的小鼠肝细胞内，萄萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)活性的下降可降低肝脏的葡萄糖输出，从而改善葡萄糖耐受力的降低[33]。总之，激活或抑制肝脏ChREBP对胰岛素敏感性的影响机制复杂，因为它可能高度依赖于遗传、饮食或环境因素。以上有关肝特异性敲除ChREBP动物模型的研究结果为进一步深入阐述明其在代谢综合征中的关键作用提供了重要的实验依据。另外，王冰等[34]学者近年研究显示在1型糖尿病小鼠的肾脏中，FAS和ChREBP的表达量均较非糖尿病小鼠降低，胰岛素可上调糖尿病小鼠肾脏FAS和ChREBP的表达水平。

4.2 ChREBP与肿瘤的关系 肿瘤细胞代谢模式的改变为细胞增生供能。大多数转化细胞摄取高水平的葡萄糖通过有氧糖酵解产生ATP。在有氧糖酵解的过程中，糖分子中大部分碳原子参与脂质的重新合成和核苷酸合成。ChREBP作为葡萄糖反应转录因子在肝细胞内启动新的葡萄糖代谢模式，在非增生性肝细胞的脂质合成中发挥重要的作用。Tong等[35]近年来研究发现，ChREBP能被丝裂原刺激诱导表达，对于细胞的高效率增生必不可少。抑制ChREBP的表达，会导致有氧糖酵解，脂肪酸从头合成和核苷酸的生物合成都会减少；但可刺激线粒体呼吸，提示细胞从有氧糖酵解代谢转变为氧化磷酸化。在体外实验中chREBP受抑制的细胞内出现p53重新活化和细胞周期阻滞。而在体内抑制ChREBP可导致p53依赖的肿瘤生长减缓。这些研究结果表明chREBP在糖代谢转向有氧模式和抑制p53活性中发挥重要的作用。

耿西林等学者[36]近年分别用qRT-PCR、免疫组化、Westernblot法检测肝癌组织与癌旁组织以及多种HCC细胞系与正常肝细胞系中ChREBP的mRNA与蛋白表达发现：ChREBP的mRNA与蛋白表达在肝癌组织中表达均明显高于癌旁组织，在所有HCC细胞系中均明显高于正常肝细胞系。干扰ChREBP表达后，HCC细胞发生明显G1-S期阻滞及细胞增生明显降低，但细胞凋亡未发生明显变化。即ChREBP在HCC中表达升高，可能通过调控细胞周期促进HCC细胞的增生，从而在HCC的发展中起了重要的作用。近年亦有证据表明ChREBP的表达和/或活性在肿瘤的早期和晚期阶段有不同的调节。ChREBP在永生化造血细胞中有丝分裂时受到诱导表达，而在非小细胞肺癌的TGF-β1/Snail1介导的上皮-间质转化(EMT)期间，其表达则有所抑制[35，37]。

4.3 ChREBP与Williams-Beuren综合征 最初的研究发现遗传性Williams-Beuren综合征缺失17个基因，ChREBP是其中之一。该疾病主要表现为心脏、神经系统和皮肤的异常，约75%的患者表现出糖耐量降低和隐性糖尿病。Cairo等[4]研究发现ChREBP在细胞增生或分化中发挥重要作用。作为新发现的Mlx结合因子，可能导致Williams-Beuren综合征的某种症状，但具体表现及机制目前尚不清楚。

5 展望

目前，脂肪肝、胰岛素抵抗、肥胖等代谢性疾病严重危害着人类的健康，探讨这些疾病的发生机制具有重要的意义。ChREBP的发现加深了对肝细胞中糖类和脂类代谢调节的了解，ChREBP-Mlx异二聚体调控肝葡萄糖利用和能量平衡，并且ChREBP在肝脂肪变性、肥胖症、2型糖尿病、胰岛素耐受性等方面起重要作用。ChREBP的发现已将葡萄糖作为信号分子与多种葡萄糖依赖性转录调控途径相联系，特别是一些参与糖酵解和脂肪生成过程的基因，其还参与了其他信号传导和代谢途径，并参与了肿瘤的发生。随着分子生物学及人类基因组学的发展，人们对疾病的机制及信号通路机制有了更深入的认识，而分子靶向药物治疗也为越来越多的患者带来福音。ChREBP有望成为肥胖等疾病治疗的新靶点。进一步了解ChREBP对葡萄糖反应基因的调控机制有助于进一步研究代谢综合征的病理机制，对治疗相关疾病提供新的思路和手段[38]。通过加深对ChREBP的认识和了解，可能会有助于我们在未来找到某些代谢性疾病及恶性肿瘤治疗的新机会。