程氏蠲痹汤的抗炎镇痛作用

牛小雪，陈培柱，杜玉芝，徐红梅

(合肥工业大学生物与医学工程学院药学系，安徽 合肥 230009)

程氏蠲痹汤是清代新安医家程国彭创立的著名方剂，临床用于治疗痹病十分有效[1-3]，为历代医家所推崇。风湿热、类风湿关节炎相当于中医学“痹证”范畴。程氏蠲痹汤由羌活、独活、秦艽、当归等10味药材组成，具有祛风除湿、舒筋通络、活血行滞等功效[4-5]，对类风湿关节炎有较好的疗效，但有关其治疗类风湿关节炎的实验研究尚显不足。本实验对程氏蠲痹汤的抗炎、镇痛活性进行评价，为其临床治疗类风湿关节炎提供实验依据。

1 材料

1.1 试验药物 中药材秦艽(批号 15020703)、羌活(批号 14011505)、独活(批号 14042504)、川芎(批号 14051601)、当归(批号 14051401)、海风藤(批号 15020603)、桑枝(批号 14041803)、木香(批号 14031602)、乳香(批号 13112901)和甘草(批号 13050801)为程氏蠲痹汤原方药物，均购自合肥乐家老铺中药材有限公司。

药材中挥发油成分的提取：取独活、海风藤各100 g，乳香、木香各60 g，投入10 L圆底烧瓶，加入8倍量蒸馏水，热回流提取2次，收集挥发油，4 ℃遮光储藏、备用。

药材中醇溶性、水溶性成分的提取：取独活、川芎、当归和秦艽各100 g，甘草30 g，羌活60 g和桑枝150 g，用75%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，过滤、滤液浓缩得浸膏A。药渣再用水煎煮2次，每次2 h，过滤、浓缩得浸膏B。程氏蠲痹汤药液：合并上述醇提物(A)、水提物(B)和挥发油，减压浓缩，使药液的生药含量为1.02 g/mL，4 ℃遮光储藏，备用。使用前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液稀释至1.02、0.51、0.255 g/mL。

雷公藤多苷片(glucosides ofTripterygiumwifordii，GTW；批号 141202)：上海复旦复华药业有限公司；阿司匹林肠溶片(批号 100901)：广东九名制药有限公司。实验前均用0.5%羧甲基纤维素钠配制成所需浓度。

1.2 试剂 二甲苯：国药集团；角叉菜胶(批号 CAS 11114-20-8)：Adamas公司；弗氏完全佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA；批号 CAS 9007-81-2)：Sigma公司。

1.3 仪器 JA 2004 N 型电子天平：上海精密科学仪器公司；YLS-7B足趾容积测量仪：淮北振华公司；RB-200热板仪：上海益联科教设备有限公司；打孔器。

1.4 动物 雌性昆明种小鼠[100只，体质量(20±2)g]、雄性昆明种大鼠[96只，体质量(180±20)g]：均由安徽医科大学实验动物中心[生产许可证号为SCXK(皖)2017-001]提供。

2 方法

2.1 程氏蠲痹汤对热板致痛小鼠痛阈的影响 取雌性昆明种小鼠，放在(55.0±0.5)℃的金属热板上，测定每只小鼠的痛阈值(即疼痛反应潜伏期，指小鼠接触热板至舔后足的时间)，痛阈在5～30 s内为痛阈正常小鼠。取痛阈正常小鼠50只，随机分为空白组，阿司匹林组(0.05 g/kg)，程氏蠲痹汤高剂量(20.40 g/kg，相当于60 kg成人临床用药量的24倍)、中剂量(10.20 g/kg)、低剂量(5.10 g/kg)组。各组小鼠灌胃给药，每日1次，连续7 d，空白组小鼠给予等容积溶媒。末次给药1 h后，以小鼠出现舔后足行为作为疼痛反应指标，记录自投入热板至出现舔后足的潜伏期，连续测量3次，取平均值为痛阈。镇痛效应的计算公式：痛阈提高百分率=[(给药后痛阈-给药前痛阈)/给药前痛阈]×100%。

2.2 程氏蠲痹汤对小鼠急性炎症耳肿胀度的影响 取雌性昆明种小鼠50只，分组与给药同“2.1”项。末次给药1 h后，将0.025 mL二甲苯均匀涂抹于小鼠左耳正反两面，以右耳为对照，复制小鼠急性炎症模型。致炎30 min后，将小鼠颈椎脱臼处死，用直径9 mm的打孔器，在左右耳廓相同部位打孔取样，及时称量耳片质量，计算耳肿胀度(左右耳片质量差值)及耳肿胀抑制率。耳肿胀抑制率=[(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度] ×100%。

2.3 程氏蠲痹汤对大鼠急性炎症足肿胀率的影响 取雄性SD大鼠48只，随机分为6组，分别为正常组、模型组、GTW组(0.01 g/kg)和程氏蠲痹汤高剂量(10.20 g/kg)、中剂量(5.10 g/kg)、低剂量(2.55 g/kg)组。各组大鼠灌胃给药，正常组和模型组均灌胃等容量空白溶剂，每日1次，连续14 d。末次给药后1 h，于大鼠左后足踝关节处作标记，测量大鼠足体积。除正常组外，在其他组大鼠左后足跖皮内注射0.1 mL角叉菜胶溶液复制炎症模型，并于致炎后1、2、4、6 h分别测定大鼠左后足体积。足肿胀率=[(Vt-Vn)/Vn]×100%，Vn、Vt分别代表大鼠致炎前、致炎后足体积。

2.4 程氏蠲痹汤对大鼠慢性炎症足肿胀率和屈关节疼痛评分的影响 动物分组及给药同“2.3”项。除正常组外，其余各组大鼠均于左后足跖皮内注射0.1 mL CFA复制佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)模型。致炎后第15天灌胃给药，每日1次，连续14 d。

2.4.1 足肿胀度的检测 在致炎前及致炎后第14、17、20、22、25、28天分别测量各组大鼠的左后足体积及继发侧足体积，并计算各组大鼠足肿胀率，计算方法同“2.3”项。

2.4.2 屈关节疼痛评分(缩腿嘶鸣评分) 在致炎第0、5、14、20、26天，进行背屈和趾屈关节疼痛实验评分。具体如下：用固定器将大鼠头部固定，使其两后腿和尾部伸出，稳定后进行测定。①趾屈：将大鼠左侧踝关节向脚掌侧缓慢且柔和弯曲，每间隔5 s进行一次，共5次。若大鼠出现短促而明显的缩腿或嘶叫反应则评分为1，无反应评分为0。分别记录其缩腿和嘶叫评分，每种指标的评分为0～5分，两种指标的评分相加，每只大鼠的总评分为0～10分。②背屈：将大鼠左侧踝关节向脚背侧缓慢且柔和弯曲，评分方法同趾屈关节评分。用缩腿和嘶叫二者的总评分来反映大鼠关节疼痛的程度。

3 结果

3.1 程氏蠲痹汤对小鼠痛阈的影响 与空白组比较，给药组小鼠更耐痛，痛阈提高百分率显著上升(P<0.05)；其中程氏蠲痹汤高、中剂量组痛阈提高百分率与阿司匹林组相近，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 程氏蠲痹汤对小鼠痛阈的影响

注：与空白组比较，*P<0.05；与阿司匹林组比较，#P<0.05

3.2 程氏蠲痹汤对小鼠耳肿胀度的影响 与空白组比较，二甲苯致炎后，阿司匹林组和程氏蠲痹汤高、中剂量组小鼠耳肿胀度显著降低(P<0.05)；程氏蠲痹汤低剂量组对小鼠耳肿胀的抑制率显著低于阿司匹林组(P<0.05)，而其高、中剂量组药效与阿司匹林组的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3.3 程氏蠲痹汤对大鼠急性炎症足肿胀率的影响 角叉菜胶致炎1 h后，即可引起模型组大鼠足部显著肿胀(P<0.05)；在致炎后各时间段，GTW组和程氏蠲痹汤高、中剂量组大鼠的足肿胀率均显著低于模型组(P<0.05)，且致炎后4 h效果最为显著；程氏蠲痹汤低剂量组大鼠足肿胀率在致炎后2～6 h与GTW组的差异有统计学意义(P<0.05)，而其高、中剂量组与GTW组的差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 程氏蠲痹汤对小鼠耳廓肿胀度的影响

注：与空白组比较，*P<0.05；与阿司匹林组比较，#P<0.05

表3 程氏蠲痹汤对大鼠急性炎症足肿胀率的影响

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与GTW组比较，#P<0.05；与致炎1 h后比较，aP<0.05；与致炎2 h后比较，bP<0.05；与致炎4 h后比较，cP<0.05

3.3 程氏蠲痹汤对AA大鼠疼痛与足肿胀率的影响 AA大鼠在致炎后第14 d，其原发侧和继发侧足肿胀率、屈关节疼痛评分明显高于正常组(P<0.05)；与模型组比较，致炎后第20天，GTW组和程氏蠲痹汤高、中剂量组大鼠原发侧及继发侧足肿胀率和屈关节疼痛评分明显降低(P<0.05)；且程氏蠲痹汤高、中剂量组大鼠足肿胀率和屈关节疼痛评分与GTW组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、表5。

表4 程氏蠲痹汤对AA大鼠原发侧和继发侧足肿胀率的影响

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与GTW组比较，#P<0.05

4 讨论

炎症是机体对损伤因子所发生的防御反应，根据持续时间不同分为急性和慢性。急性炎症以发红、肿胀、疼痛等为主要症状，而慢性炎症可由急性炎症迁延而来，病程较长，且临床表现多样，诊断及治疗相对困难。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，其基本病理是由免疫失控所引发的慢性滑膜炎症，主要表现为关节肿痛、僵直，屈伸不利[6-7]。持续的慢性炎症可引发关节软骨和骨质的损害，导致患者关节畸形，给患者带来极大的痛苦。目前临床上对RA的治疗主要是缓解急性发作症状(如关节疼痛和肿胀)，抑制炎性因子的释放以及提高机体免疫抑制功能等。中医药因其治疗RA疗效确切，毒性和不良反应较小而引起医学界的极大关注。

表5 程氏蠲痹汤对AA大鼠缩腿嘶鸣评分的影响

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与GTW组比较，#P<0.05

现代药理学研究表明，程氏蠲痹汤方中秦艽具有良好的抗炎、镇痛作用，可调节机体炎性因子如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-4的表达[8-9]。海风藤提取物可以通过降低大鼠滑膜组织中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、核因子-κB、核因子-κB抑制因子和核因子-κB激酶抑制因子及其mRNA的表达，发挥其抗炎、抗风湿作用[10]。桑枝、木香可通经活络，佐以当归、川芎、乳香可理气养血、活血行滞。许霞等[11]研究发现，程氏蠲痹汤加减方含药血清可以下调AA大鼠外周血单核细胞肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的水平。但程氏蠲痹汤的抗炎镇痛作用及其对类风湿关节炎的治疗效果却鲜见报道。本实验通过热板法和二甲苯致炎法[12-13]考察程氏蠲痹汤对小鼠的抗炎镇痛效果；利用角叉菜胶[14]和弗氏完全佐剂复制大鼠炎症模型，分别评价程氏蠲痹汤对大鼠急性和慢性炎症的疗效。结果显示，20.40、10.20 g/kg程氏蠲痹汤可显著提高小鼠的痛阈，抑制急性耳肿胀，10.20、5.10 g/kg程氏蠲痹汤可显著缓解大鼠炎性足肿胀，并减轻AA大鼠屈关节疼痛。结果表明，程氏蠲痹汤对小鼠、大鼠的急性和慢性炎症均具有良好的抗炎、镇痛效果。本研究结果可为程氏蠲痹汤治疗RA提供实验依据，但其抗炎镇痛的机制尚待进一步研究。