左归补髓生血方对再生障碍性贫血小鼠骨髓有核细胞凋亡的影响

张 鹏，何春玲，郭雨晨，李 玮，董昌虎

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000)

再生障碍性贫血(以下简称“再障”)为一类骨髓造血能力低下、全血细胞减少，以贫血、出血、感染为主要临床表现的骨髓造血功能衰竭的综合疾病[1]。既往认为其发病机制为造血干细胞的缺陷、自身免疫功能紊乱、造血微环境异常3个因素。随着对其研究的深入，以T淋巴细胞介导的免疫异常被倾向于认为是再障的主要发病机制[2]。但不管是哪一种发病机制，其最终的结果是骨髓内造血干细胞减少，造血功能发生衰竭。现阶段针对再障的各种治疗方法，最终目的是为了改善骨髓的造血功能，提高生活质量。西医以免疫抑制剂与雄激素为主治疗再障。实践证明，中医药单用或联合西药能够提高再障的临床疗效并且降低毒性和不良反应。本研究利用二甲磺酸丁酯联合环磷酰胺复制再障小鼠模型，观察左归补髓生血方对再障模型小鼠的治疗作用以及对骨髓中造血细胞凋亡的影响，旨在探究左归补髓生血方对再障者骨髓中造血干细胞的改善作用。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级ICR雄性小鼠40只，体质量18～22 g，平均体质量18.5 g，由西安交通大学医学实验动物中心[生产许可证编号：SCXK(陕)2012-003]提供。

1.2 主要试剂与药品 左归补髓生血方(黄牛骨髓 14 g，紫河车、熟地黄、山药、枸杞子、山茱萸、川牛膝、鹿角胶、龟板胶、菟丝子各7 g)药材由陕西中医药大学第二附属医院药剂科提供，经水煎、浓缩、过滤，配制成约100 mL药液，浓度约为1.54 g/mL，装入干净的100 mL塑料瓶后，置于4 ℃冰箱中保存备用，使用前充分摇匀并煮沸。司坦唑醇(广西壮族自治区南宁百会药业公司，每片2 mg，每盒24片，国药准字号为H45020728，批号为1510027)：使用灭菌用水配制成0.12 mg/mL的悬混液；TUNEL试剂盒：上海Roche制药公司；蛋白酶K工作液、DAB工作液、苏木素-伊红染色试剂盒：武汉赛维尔生物公司；二甲磺酸丁酯、环磷酰胺：上海索莱宝生物公司；二甲苯、梯度乙醇、中性树胶、磷酸盐缓冲液：天津天力化学试剂厂。

2 方法

2.1 模型复制、分组以及给药 参考文献[3-5]方法并加以改进，小鼠适应饲养1周后，随机选取10只设为正常组，其余30只小鼠用于复制再障模型，于第1、3、5、7、9、11天腹腔注射二甲磺酸丁酯10 mg/kg，第2、4、6、8、10、12天注射环磷酰胺20 mg/kg，模型复制时间为12 d。将复制成功的再障模型小鼠随机分成模型组、中药组与西药组，各组12只小鼠，正常组与模型组给予等容量生理盐水灌胃，中药组以左归补髓生血方药液灌胃，根据成人等效剂量[6]换算为15.4 g/kg，西药组给予司坦唑醇悬混液(给药剂量为2.4 mg/kg)灌胃，中药组与西药组灌胃容积均为20 mL/kg，共灌胃15 d。

2.2 标本采集 实验第28天，各组小鼠腹腔注射10%水合氯醛(10 mL/kg)进行麻醉，麻醉后右眼摘取眼球，取血约1 mL，滴入经肝素处理过的EP管后，置于全自动动物血细胞分析仪中检测血常规；颈部脱臼处死小鼠，取其右侧股骨，置10%甲醛中固定24 h，放入10% EDTA脱钙液中脱钙21 d，脱水，透明，石蜡包埋，制备4 μm切片。按照试剂盒说明书，分别采用苏木精-伊红染色法和TUNEL法检测股骨内有核细胞凋亡。

置于光学显微镜下分别观察骨髓组织病理切片以及凋亡细胞，细胞核中有棕黄色颗粒者或胞浆或胞膜棕黄色为凋亡阳性细胞。在400倍显微镜下，观察凋亡细胞的分布，每组随机选10个阳性视野，每个视野计数100个细胞，计算平均凋亡细胞数所占百分比作为凋亡指数。

3 结果

3.1 各组小鼠外观行为观察 正常组小鼠的精神、行动以及反应良好，皮毛有光泽，口及四肢末端红润，饮食正常；模型组小鼠精神萎靡，活动减少伴扎堆，唇瓣灰白，毛色暗乱，饮食减少；中药组与西药组小鼠精神明显好转，饮食有所增加，皮毛较光泽。

3.2 各组小鼠外周血白细胞(white blood cell, WBC)、红细胞(red blood cell, RBC)、血小板(platelet, PLT)计数和血红蛋白(hemoglobin, Hb)浓度比较 与正常组比较，模型组小鼠外周血WBC、RBC、PLT计数和Hb浓度明显减少(P<0.05)；与模型组比较，中药组和西药组外周血WBC、RBC、PLT计数和Hb浓度明显升高(P<0.05)；中药组和西药组WBC、RBC、PLT计数和Hb浓度比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠外周血WBC、RBC、PLT计数和Hb浓度比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

3.3 各组小鼠骨髓组织形态学变化比较 正常组小鼠骨髓细胞增生活跃，可见红系、粒系和巨核系细胞，细胞形态均无明显异常，可见巨核细胞和成簇血小板以及少量非造血性细胞，成熟红细胞大小均匀，染色正常。与正常组比较，模型组小鼠骨髓增生极度减少，红系、粒系、巨核细胞系均明显减少，造血组织明显减少，非造血细胞团易见，可见到大量的脂肪空泡，并伴有明显的充血现象。与模型组比较，中药组以及西药组小鼠骨髓增生程度好转，红系、粒系、巨核细胞系均有明显增生，可见少量非造血组织及脂肪细胞，造血组织结构明显修复，空泡显著减少。见图1。

3.4 各组小鼠骨髓腔内有核细胞凋亡率比较 与正常组比较，模型组小鼠骨髓内大量空泡伴充血，有核细胞数显著减少，TUNEL染色多为阳性，凋亡率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，中药组和西药组小鼠骨髓有核细胞显著增加，骨髓腔内充血及空泡减少，有核细胞凋亡率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；中药组与西药组骨髓有核细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2。

注：A.正常组；B.模型组；C.西药组；D.中药组

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

注：A.正常组；B.模型组；C.西药组；D.中药组；红色箭头示凋亡细胞，凋亡细胞明显固缩，核致密深染为棕黄色或棕褐色，呈均匀的颗粒状

图2各组小鼠骨髓中有核细胞凋亡情况(TUNEL法，DAB显色后苏木素染色，10×40倍)

4 讨论

随着再障发病率的逐年升高，对其具体发病机制的研究逐渐深入，取得了一系列阶段性的成果，对于临床诊疗具有极大的指导意义。基于再障在临床上主要表现为一系或多系的血细胞减少，并伴有贫血、感染以及出血等的现实，当前研究发现虽然再障的主要发病机制是T淋巴细胞的过度活化导致的免疫紊乱，但主要环节是造血干祖细胞在质或量上的异常。在对再障发病机制的研究方面，无论是“种子”“土壤”学说亦或是“虫子”学说，都认为是造血细胞的凋亡、坏死，引发骨髓中造血细胞的缺失，最终导致骨髓衰竭[7]。针对上述研究，本实验通过复制再障小鼠模型，使用左归补髓生血方进行干预，旨在探究左归补髓生血方对再障者骨髓中造血干细胞的改善作用。本次实验利用二甲磺酸丁酯联合环磷酰胺成功复制再障模型小鼠，与正常组比较，外周血WBC、RBC、PLT等指标明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；骨髓增生程度减低，造血细胞(红系、粒系、巨核系)及造血组织均减少，非造血组织增多。司坦唑醇为蛋白同化类固醇类雄激素药，是临床治疗再障的常用药物，雄激素经吸收后在体内被还原成5α-双氢睾酮和5β-双氢睾酮，通过刺激肾脏产生红细胞生成素(erythropoietin，EPO)，使静止期造血干细胞向对EPO有反应阶段分化，并外源性补充EPO，增强造血细胞对EPO的反应性，促进骨髓造血[8]。本实验中加入司坦唑醇作为对照组，治疗后小鼠一般状况改善明显，外周血中WBC、RBC、PLT计数和Hb浓度上升，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，骨髓腔内造血组织增多，增生程度好转，提示司坦唑醇能有效地治疗再障。

细胞凋亡又称“细胞程序性死亡”，正常组织通过细胞凋亡途径可以清除体内某些异常细胞，最终保持机体内环境的动态平衡[9]。再障患者CD34+T细胞表面Fas抗原表达水平明显增加[10]，推测再障患者可能存在造血细胞的过度凋亡。Fas(CD95+T细胞抗原)是一种膜蛋白，表达于细胞表面，当与配体结合后，可以传递凋亡信号，引发骨髓CD34+T细胞发生大量凋亡，最后使造血功能衰竭[11]。因此，降低再障患者骨髓内造血细胞凋亡是治疗再障的关键环节。本研究结果表明，左归补髓生血方明显降低再障小鼠骨髓腔内有核细胞凋亡率(P<0.05)，其作用与司坦唑醇相当(P>0.05)，提示左归补髓生血方能够通过降低再障小鼠骨髓内造血细胞凋亡而改善造血功能，缓解病情进展。

根据再障所引起的贫血、出血、感染等典型症状，可将其归属为中医学“虚劳”“髓劳”“血劳”等范畴。《素问·阴阳应象大论》提出“肾生骨髓”，肾为先天之本，受五脏六腑之精气而藏之，主骨生髓，肾精充则化血，肾精亏则骨髓造血功能不足，导致生血障碍。闫昱江等因此提出“补肾为本、健脾益气”治疗再障的观点[12]。左归补髓生血方是在补肾名方左归丸的基础上，加入紫河车与牛骨髓而制成的自拟药方。方中熟地黄滋肾填精，山药、山茱萸滋补肝、脾；枸杞子补精，川牛膝补血，菟丝子补肾气，鹿角胶、龟板胶为血肉有情之品，峻补精髓；紫河车补气养血，牛骨髓补血益精、止渴、止血，用于精血亏损、虚劳羸瘦之证。全方共奏滋肾补阴、填精益髓、益气养血之效。本次实验结果表明，左归补髓生血方可改善再障小鼠的一般状况，显著提高外周血WBC、RBC、PLT计数和Hb浓度(P<0.05)，使再障小鼠骨髓增生程度明显恢复，造血组织比例明显增加，并且与司坦唑醇组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示左归补髓生血方对再障小鼠具有确切的疗效。

综上所述，本研究证实，左归补髓生血方能够改善再障模型小鼠的一般状态，提升外周血象，抑制骨髓中造血细胞凋亡，改善并恢复造血功能，最终达到治疗再障的作用。本研究为临床应用左归补髓生血方治疗再障提供了实验依据。