毛细管电泳法检测糖化血红蛋白的方法学性能评价

肖翔 钟阳青 陈艳清 贾建 张伟龙 潘理想

【摘要】 目的：評价miniCAP Flex Piercing全自动毛细管电泳分析系统检测糖化血红蛋白（HbA1c）的方法学性能。方法：精密度评价按照美国临床和实验室标准化委员会（CLSI）颁布的EP15-A3文件的要求进行初步评价；分析测量范围评价按照EP6-A2文件的要求进行；准确度评价使用EP9-A2文件，与高效液相色谱法检测结果进行比对，并计算其在医学决定水平处的偏倚；生物参考区间的验证采用C28-A2文件的方案进行；收集异常高值和异常低值的新鲜标本进行携带污染率的评价；收集确诊的异常血红蛋白病患者的标本进行抗干扰能力的评价。结果：检测系统检测HbA1c浓度在4.50%和7.50%时的重复性精密度分别为1.14%、0.70%，期间精密度分别为1.80%、1.36%；当HbA1c浓度在3.6%～12.1%时检测结果呈线性；与日本arkray公司的HA-8160高效液相色谱法检测结果比较，回归方程式为y=0.995x-0.177，线性相关系数R2=0.994，相关性较好，在医学决定的水平10%、16%处的偏倚分别为-2.77%、-1.61%均小于5.0%；携带污染率为1.18%小于3.00%可接受；选取的20份健康参考个体，其HbA1c检测结果均在3.6%～6.1%，参考区间可用；对广东地区常见的血红蛋白变异体HbE、HbS、HbC、HbD有良好的抗干扰能力。结论：毛细管电泳法检测糖化血红蛋白的精密度、准确度、分析测量范围、携带污染率、生物参考区间均符合临床检测的需要，在抗血红蛋白变异体的干扰能力上优于高效液相色谱法。

【关键词】 毛细管电泳； 糖化血红蛋白； 性能评估

【Abstract】 Objective：To evaluate the methodological performance of miniCAP Flex Piercing automatic capillary electrophoresis system for detection of glycosylated hemoglobin.Method：The precision of the evaluation according to the clinical and Laboratory Standards Committee （CLSI） issued by the EP15-A3 requirements analysis；measuring range was evaluated according to the EP6-A2 documents；accuracy evaluation method using the EP9-A2 file，detection results compare with high performance liquid chromatography；verify the biological reference intervals by C28-A2 file program；abnormal collection of high value and low value of the fresh specimens of abnormal carrying rate of pollution evaluation；evaluation of abnormal hemoglobin disease patients were collected specimens of anti jamming ability.Result：The repeatability accuracy of detecting HbA1c concentration at 4.50% and 7.50% respectively was 1.14% and 0.70%，the precision was 1.80% and 1.36% respectively.The results were linear when the concentration of HbA1c ranged from 3.6% to 12.1%；compared with the HA-8160 high performance liquid chromatography of arkray Company of Japan，the regression equation was as follows：y=0.995x-0.177，linear correlation coefficient R2=0.994，at the level of 10% and 16% of the medical decision，the bias was -2.77% and -1.61%，respectively，which was less than 5.0%；the carrying pollution rate of was 1.18%，which was less than 3.00% acceptable；the HbA1c test results of the 20 healthy reference individuals were all in the range of 3.6%-6.1%，and the reference range was available；it has good anti-interference ability to the common hemoglobin variant HbE，HbS，HbC，HbD in Guangdong area.Conclusion：The analysis performance of miniCAP HbA1c determination system meets the requirements of routine clinical application，the interference ability of hemoglobin variant is better than that of high performance liquid chromatography.

【Key words】 Capillary electrophoresis； Glycosylated hemoglobin； Performance evaluation

First-authors address：Tangxia Hospital of Dongguan City，Dongguan 523722，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.11.033

糖化血红蛋白是血红蛋白与血糖进行不可逆的非酶促反应的产物，可以反映近2～3个月血糖的水平，是判断糖尿病长期控制的良好指标，同时也与糖尿病并发症相关[1-3]。糖化血红蛋白检测目前临床上使用较多的为高相液相色谱法，该法具有操作简单、快速、结果可靠等特点，但是对于血红蛋白变异体的抗干扰能力较差[4-5]。广东地区为珠蛋白生成障碍性贫血及血红蛋白病的高发地区[6-8]，因此在选用检测方法的时候需要综合考虑。毛细管电泳法是一种重复性好、结果可靠且能识别血红蛋白变异体的方法[9]。本研究通过精密度、准确度、分析测量范围、抗干扰能力和生物参考区间等指标来评估毛细管电泳法糖化血红蛋白检测的方法学性能，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 日本arkray公司提供的配套校准品和质控品；法国sebia公司提供的配套定标品和校准品；收集2016年11月-2017年5月来东莞市塘厦医院就诊的通过毛细管血红蛋白电泳检测和基因分析确诊为HbE、HbS、HbC、HbD等血红蛋白病的患者EDTA标本，同时收集HbA1c各浓度的标本40份，浓度范围分布毛细管电泳法厂家说明书申明的整个分析测量范围。

1.2 仪器试剂 高效液相色谱法为日本arkray公司的HA-8160型仪器，使用配套试剂、定标液、质控品；毛细管电泳法为法国sebia公司的minicap Flex Piercing型分析仪（以下简称miniCAP），使用配套试剂、定标液、质控品。仪器使用严格按照厂家说明的要求进行操作、校准和维护保养。

1.3 方法

1.3.1 精密度 采用EP15-A3文件的规定进行[10]，即使用sebia公司提供的两个浓度水平的质控品，每天测定1批，每批重复测定5次，连续测定5 d，通过统计分析计算重复性精密度和期间精密度，精密度以不精密度（CV%）表示，按照指南的要求CV<2.0%为可接受。

1.3.2 准确度 采用EP9-A2文件的规定进行[11]，即每天选择分布在厂家声明的整个分析测量范围内的标本8例，首选在HA-8160上检测两次，然后在2 h内使用miniCAP检测两次，连续5 d。通过回归分析，建立数学模型，计算在医学决定水平处的偏移。以偏倚小于1/2允许总误差（5%）为可接受。

1.3.3 分析测量范围 采用EP6-A3文件的规定进行[12]，即选择高（H）、低（L）两个浓度水平的标本，按照5L、4L+H、3L+2H、2L+3H、L+4H、5H的比例进行混合，制配实验样品，将实验样品按照隨机顺序上机检测，每个样品重复测试2次，顺序为随机放置，避免携带污染的影响，通过线性拟合，得出最佳线性方程y=ax+b，方程式的斜率a在0.97～1.03，截距b与0无统计学差异，线性相关系数r>0.95，为可接受。

1.3.4 抗干扰能力 选择经过毛细管血红蛋白电泳筛选的各种血红蛋白变异体标本，采用地贫基因分型方法加以确诊，本次实验收集到HbE、HbS、HbC、HbD四种类型的血红蛋白变异体，其血红蛋白变异体的含量分别为12.6%、8.4%、3.2%、4.8%；实验样品上机检测，同时使用正常人的标本与其进行1∶1的混合，混合样品上机检测，计算混合样品测定值与预期值得偏倚，偏倚小于5.0%为可接受。

1.3.5 携带污染率 选择HbA1c浓度为12.1%和3.6%的高值和较低值标本各1份，首先连续测定高值标本3次（H1、H2、H3），随后立即连续测定低值标本3次（L1、L2、L3），记录所有数据，按下列公式计算：携带污染率=（L1-L3）/（H3-L3）×100%，携带污染率CV<3.0%为可接受。

1.3.6 生物参考区间 采用C28-A2文件的规定进行[13]，通过制定健康状况调查表，辅以血糖、血常规、血红蛋白电泳等检测结果，选取20个健康参考个体为自愿者，参与实验的自愿者统一在次日上午10：00抽取静脉EDTA抗凝血标本1 mL，在2 h内上机检测。采用“1/3”规则进行离群值检验，剔除离群值，并用新的参考个体代替。若20份标本中不超过2份标本的检测值超出参考区间，则表明现行的参考区间可以接受。

1.4 统计学处理 所有数据均采用SPSS 19.0软件进行统计分析和处理，计量资料以（x±s）表示，相关性分析采用线性回归分析。

2 结果

2.1 精密度验证结果 使用sebia公司提供的两个浓度水平的质控品，每天测定1批，每批重复测定5次，连续测定5 d。质控品的HbA1c浓度均值分别为4.5%和7.5%，分析系统在这两个浓度水平处的重复性精密度分别为1.14%和0.70%，期间精密度分别为1.80%和1.36%，结果均小于2.0%，分析系统精密度可接受，见表1。

2.2 准确度 选择HbA1c浓度分布整个厂家申明的分析测量范围的标本40份与HA-8160分析仪进行比对，通过离群点检测，未发现离群点，得出回归方程式为y=0.995x-0.177，相关系数R2=0.994，线性相关性较好，见图1。糖化血红蛋白的医学决定水平为10%和16%，将两者代入方程式，偏倚分别为-2.27%和-1.61%，均小于5.0%，结果可接受。

2.3 分析测量范围 选择3.6%和12.1%两个浓度的样本进行比例混合，按照EP6-A2文件的规定执行，通过统计学分析回归方程式最佳拟合曲线为一元一次方程，方程式为y=1.016x-0.133，线性相关系数R2=0.999，满足斜率a在0.97～1.03，截距b与0无差异，线性相关系数r>0.95的要求，故判断miniCAP毛细管电泳法糖化血红蛋白检测在3.6%～12.1%检测结果呈线性，见图2。

2.4 抗干扰能力 HbE、HbC、HbD、HbS四种血红蛋白变异体在毛细管电泳中被清晰的分离出；四种变异体的HbA1c浓度分别为5.6%、6.3%、4.7%、8.6%。选择糖化血红蛋白正常的标本（HbA1c浓度为5.5%）与变异体标本1∶1混合后上机检测，计算理论值与实测值得的偏倚。四种变异体标本的偏倚分别为2.70%、3.39%、3.92%、-2.13%，偏倚均小于5.0%，判断结果可接受，故认为常见的血红蛋白变异体（HbE、HbC、HbD、HbS）对HbA1c的检测无影响。见表2。

2.5 携带污染率 选择HbA1c浓度为12.1%的高值标本和3.6%的低值标本各1份，首先连续测定高值标本3次（H1、H2、H3），随后立即连续测定低值标本3次（L1、L2、L3），记录所有数据，按下列公式计算：携带污染率=（L1-L3）/（H3-L3）×100%。结果携带污染率为1.18%，小于3.00%，可接受。

2.6 生物参考区间 通过制定健康状况调查表、辅以血糖、血常规、血红蛋白电泳检测等各种检查，选取20例健康参考个体，每个健康参考个体都在次日上午10：00之前抽取静脉EDTA抗凝标本1 mL，在2 h内上机检测，收集结果，统计检测结果超出参考区间的标本个数，结果20份健康检查者的HbA1c结果均在3.6%～6.1%，生物参考区间符合要求。

3 讨论

糖化血红蛋白是红细胞内血红蛋白与葡萄糖长期接触后发生的一种不可逆的非酶促反应，其可反映人体2～3个月的平均血糖水平，不仅是WHO推荐的糖尿病诊断标准，也是糖尿病血糖控制目标，以及评价糖尿病治疗方案有效性的指标[14]。

目前临床实验室普遍采用的HbA1c测定方法有多种，按原理可分为两大类：一类是基于糖化与非糖化血红蛋白所带电荷的不同，如离子交换层析法、电泳法；另一类是基于糖化与非糖化血红蛋白结构的不同，如免疫法、亲和层析法及酶法等。不同方法采用的原理不同，所测组分不同，如离子交换色谱法测定HbA1c，亲和层析法测定总糖化血红蛋白（GHb）[15]。随着研究的深入糖化血红蛋白在疾病的诊断和预后判断等方面应用日益广泛，因此对糖化血红蛋白的测定的精密度和准确度提出了很高的要求。依据临床实验室管理办法和医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189）的要求[16]，新的检测系统在用于临床检测之前需要对其性能进行验证，验证指标至少需要包括精密度、准确度、分析测量范围和生物参考区间。对于HbA1c的检测是检测其占血红蛋白的比例，因此排除异常血红蛋白的影响也在考虑范围之内。异常血红蛋白可引起异常血红蛋白病，是疟疾高发地区常见的遗传性疾病，其血红蛋白变异体对目前临床常用糖化血红蛋白检测方法有一定的干扰[4]，广东作为该病的高发地区，实验室在选择HbA1c的测定方法是应该综合考虑该因素。毛细管电泳法糖化血红蛋白检测方法是sebia公司研发的一种新型检测方法，有研究报道其具有良好的精密度、准度和抗異常血红蛋白的干扰能力[2]，还能对异常血红蛋白有提示作用[17-18]。笔者所在科引进该检测系统在投入临床检测之前按照相关规定对其分析能力进行评估。

本研究采用EP1-A3方案对毛细管电泳检测系统进行精密度的初步评估，得出在4.50%和7.50%浓度水平处时的重复性精密度分别为1.14%、0.70%，期间精密度为1.80%、1.36%，按照sebia厂家的声明不精密度CV小于3.0%为合格，按照糖化血红蛋白检测指南的要求CV小于2.0%为宜，本次验证结果均小于2.0%，与徐安平等[2]的研究结果相似，故检测系统的精密度符合临床检测的要求。准确度评价采用EP9-A2文件的要求与HA-8160高效液相色谱法检测结果进行比较，其线性相关性较好，在医学决定水平10%、16%处的偏倚分别为-2.27%和-1.61%，均小于5.0%，与罗燕芬等[19]的研究结果相似，准确度符合临床检测的要求。分析测量范围评价使用EP6-A2文件的要求对检测系统的分析测量范围进行评估，结果在3.6%～12.1%时检测结果呈线性，分析测量范围评价的上限未到达厂家申明的上限，且与陈乔彬等[20]报道的可以在4.4%～18.3%呈线性比较，上限范围较窄，这是因为在评估过程中没有找到更高浓度水平的标本故未能评估检测系统的整个分析测量范围，在以后的工作中遇到高值标本随时进行评估。收集到通过毛细管血红蛋白电泳和基因分型确诊为血红蛋白HbE、HbC、HbD、HbS四种血红蛋白变异体各一份，使用正常标本对其进行1∶1稀释后检测结果与预期值的偏倚分别为2.70%、3.39%、3.92%、-2.13%，该结果大于重复性精密度，分析原因可能存在稀释变异，但是其结果小于5.0%，故判断结果可接受，即上述四种血红蛋白变异体对毛细管糖化血红蛋白检测结果无影响。分析系统的携带污染率为1.18%，大于本次实验得出的重复性精密度，大于罗燕芬等[19]0.99%，可能原因为高值标本和低值标本的HbA1c浓度差异不大引起，低值标本重复三次的结果为3.6%、3.6%、3.5%，高值标本为12.1%、12.1%、12.2%，按照公式计算时分子已经很小了，但是分每从理论上已经决定了其不会太大，故造成结果偏高，但是其小于相关文件的规定的3.0%，故认为结果可接受。生物参考区间是解释检测结果的标尺，故对其的评价至关重要，而参考区间的评价选择健康参考个体是关键，本次实验使用C28-A2文件的要求，通过查阅文献和相关指南、共识制定健康状况调查表，并对初步筛选处的参考个体进行血糖、血常规、血红蛋白电泳等检测，最后选出符合规定的20个健康参考个体，在次日上午10：00之前抽取1 mL EDTA抗凝全血，进行糖化血红蛋白分析，结果20份标本的检测结果全在3.6%～6.1%，生物参考区间满足临床检测的需要。

综上所述，毛细管电泳法糖化血红蛋白检测的精密度、准确度、分析测量范围、携带污染率、对血红蛋白变异体的抗干扰能力、生物参考区间等性能指标符合临床检测的需要，可以用于临床标本的检测。

参考文献

[1] American Diabetes Association.Standards of Medical Care InDiabetes-2016 Abridged fof Primary Care Provider[J].Clin Diabetes，2016，34（1）：3-21.

[2]徐安平，纪玲，陈卫东，等.Capillarys 2 Flex Piercing糖化血红蛋白检测系统的综合评估[J].检验医学，2016，31（2）：123-127.

[3]李卿，刘文彬，金中淦，等.毛细管电泳法检测糖化血红蛋白的分析性能評估[J].检验医学，2015，30（2）：181-184.

[4]徐胜男，温冬梅，张秀明.血红蛋白变异体对糖化血红蛋白测定方法的干扰[J].国际检验医学杂志，2014，35（17）：2345-2347.

[5]贺岩，崔学强，杜宗孝，等.BIO-RAD VARIANTⅡ测定糖化血红蛋白的性能评价及其在糖尿病筛查中的应用[J].宁夏医科大学学报，2015，34（4）：474-477.

[6]杨阳，张杰.中国南方地区地中海贫血研究进展[J].中国实验血液学杂志，2017，25（1）：276-280.

[7]唐燕青，陈秋莉，陈碧艳，等.15060例轻型α地中海贫血的基因型和血液学分析[J].中国计划生育学杂志，2017，25（1）：57-60.

[8]钟鸣，姜碧，刘惠，等.东莞地区26 906对育龄夫妇地中海贫血筛查结果分析[J].中国优生与遗传杂志，2015，23（5）：25-26.

[9] Jaisson S，Leroy N，Meurice J.First evaluation of Capillarys 2 Flex Piercing（sebia）as anew analyzer for HbA1c cassay by capillary electrophoresis[J].Clin Chem Lab Med，2012，20（10）：1769-1775.

[10] CLSI EP15-A3.User verification of precision and estimation of bias；Approved guideline-Third edition[S].CLSI，2014.

[11] EP9-A2.Measurement procedure comparison and bias stimation using patient samples；Approved guideline-third edition[S].CLSI，2013.

[12] Clinical and Laboratory Standards Institute.Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurment Procedures[S].EP6-A2，CLSI，2003.

[13] C28-A2：Clinic and Laboratory Standards Institute（CLSI）.How to Defie and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory，Approved Guideline-Second Edition[S].Jure 2000.

[14]糖化血红蛋白测定专家共识委员会.糖化血红蛋白测定专家共识[J].中华糖尿病杂志，2014，6（12）：853-855.

[15]董彩文，陈延锋，李永丽，等.糖化血红蛋白检测方法的最新研究进展[J].轻工科技，2014（9）：103-105.

[16]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL02医学实验室质量和能力认可准则[S].北京：中国计量出版社，2013：12.

[17]徐安平，纪玲，陈卫东，等.糖化血红蛋白对血红蛋白H病患者的适用性研究[J].检验医学，2016，31（8）：667-670.

[18]索明环，温冬梅，王伟佳，等.5个糖化血红蛋白检测系统对Hb NewYork合并β地中海贫血标本异常结果预警能力比较[J].临床检验杂志，2017，35（9）：649-653.

[19]罗燕芬，李有强，区颂邦，等.Sebia minicap全自动毛细管电泳仪检测糖化血红蛋白的性能评价[J].国际检验医学杂志，2016，37（16）：2299-2300.

[20]陈乔彬，李维，刘梦莹，等.Caplillarys 2Flex Piercing糖化血红蛋白检测系统性能验证[J].国际检验医学，2016，36（13）：1932-1934.