微小RNA-144-3p及其靶基因NFE2L2在宫颈癌中的表达及临床意义

王志景，王 慧，何全中，孙 力

(1.新乡医学院第三附属医院妇产科，河南 新乡 453003)

微小RNA(microRNA，miR)是一类长度约18～22个核糖核苷酸的非编码RNA，在动物和植物中均存在，可特异性与mRNA 结合，发挥转录后调控作用。近年来，miR在肿瘤发生、发展中的作用越来越受到重视，而且其在肿瘤中的作用也逐渐被阐明。miR-144-3p在多数肿瘤中呈低表达，它可以通过多种途径调控肿瘤的增殖、浸润[1-2]。本研究拟通过检测miR-144-3p及其靶基因NFE2L2在宫颈癌及癌旁组织中的表达，分析miR-144-3p在宫颈癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料收集新乡医学院第三附属医院2013年1月至2015年12月手术切除的15例宫颈癌患者的癌组织标本和癌旁组织标本，均经病理诊断证实为宫颈鳞状细胞癌。患者术前未接受过放射治疗或化学治疗。患者年龄37～69(55.5±9.5)岁，根据世界卫生组织细胞分化标准分级[3]分为：高分化7例，中分化6例，低分化2例；临床分期按国际妇产科联盟(international federation of gynecology and obstetrics，FIGO)分期标准[4]分为：Ⅰ期6例，Ⅱ期3例，Ⅲa期2例，Ⅲb期2例，Ⅳ期2例；有淋巴结转移者8例，无淋巴结转移者7例。

1.2主要试剂与仪器RNA提取试剂盒、miR反转录试剂盒、荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒、电化学发光(electro-chemi-luminescence，ECL)试剂盒及羊抗兔二抗均购自上海碧云天生物工程有限公司，兔抗人NFE2L2多克隆抗体购自美国 Abcam公司；NanoDropD-1000微量核酸定量仪购自美国Thermo 公司，7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3方法

1.3.1生物信息学技术预测miR-144-3p的靶基因通过 mirBase、TargetScan和 DIANA TOOLS等生物信息网站预测发现，NFE2L2是miR-144-3p的靶基因，本研究进一步检测NFE2L2在宫颈癌和癌旁组织中的相对表达量。

1.3.2实时荧光定量PCR检测宫颈癌及癌旁组织中miR-144-3p和NFE2L2mRNA表达分别取-80 ℃ 保存的手术切除癌组织和癌旁组织约 2 g，加入液氮研磨，从研磨碎的组织中提取总RNA，具体步骤按照试剂盒说明书进行。提取完成后测定总RNA浓度及完整性。取1 μg总RNA，反转录成cDNA，具体操作步骤按说明书进行。采用Primer Premier 5.0软件设计has-miR-144-3p的引物序列，并由上海英骏公司合成。has-miR-144-3p：5′-GCGCTACAGTATAGATGATGTAC-3′；U6：5′-UUCACGAA-UUUGCGUGUCAU-3；NFE2L2正义链为5′-ACACGGTCCACAGCTCATC-3′，反义链为5′-TGTCAATCAA-ATCCATGTCCTG-3′；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH)正义链为5′-CTTCATTGACCTCAACTAC-3′，反义链为5′-GCCATCCACAGTCTTCTG-3′。根据SYBR Green法进行荧光定量PCR，每孔设置3个复孔，以2-ΔΔCt法计算基因的相对表达水平。

1.3.3Westernblot检测宫颈癌及癌旁组织中NFE2L2蛋白表达取手术切除的宫颈癌和癌旁组织2 cm×1 cm×1 cm，将组织块剪碎成2 mm×1 mm×1 mm大小，置于1～2 mL匀浆器中球状部位，加入400 μL去污剂裂解液(含苯甲基磺酰氟)在冰上匀浆，尽量将组织碾碎。在冰上裂解30 min，裂解时反复振荡，用移液器将裂解液移至1.5 mL离心管中，于4 ℃下12 000 r·min-1离心5 min，取上清液分装于0.5 mL离心管中，-20 ℃冰箱保存。用Brady Buffer法测定总蛋白浓度，调整浓度一致后，煮沸10 min。取50 μg总蛋白质在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，转膜后一抗[Tris Buffered saline Tween(TBST)缓冲液11 000 稀释]孵育过夜，TBST漂洗3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h，ECL法显色，凝胶成像系统分析条带吸光度值。蛋白相对表达量为目标条带吸光度值与内参吸光度值的比值。

2 结果

2.1miR-144-3pmRNA在宫颈癌及癌旁组织中表达比较宫颈癌和癌旁组织中miRNA-144-3p mRNA的相对表达量分别为0.56±0.20和1.04±0.33，宫颈癌组织中miR-144-3p mRNA的表达量低于癌旁组织，差异有统计学意义(t=-8.38，P<0.05)。

2.2miR-144-3pmRNA在宫颈癌组织中的表达与临床病理特征关系结果见表1。miR-144-3p mRNA 在宫颈癌组织中的表达和患者年龄无关(P>0.05)，与细胞分化程度、临床分期和淋巴结是否转移有关(P<0.05)。

表1 miR-144-3p mRNA表达量与宫颈癌临床特征的关系Tab.1 Relationship between the expression of miR-144-3p mRNA and clinical characteristic cervical cancer

2.3NFE2L2mRNA及蛋白在宫颈癌和癌旁组织中的表达NFE2L2蛋白的表达见图1。NFE2L2 mRNA在宫颈癌组织和癌旁组织中的相对表达量分别为4.41±1.61和0.88±0.10，NFE2L2蛋白在宫颈癌组织和癌旁组织中的相对表达量分别为 0.29±0.04和0.15±0.03；NFE2L2 mRNA及蛋白在宫颈癌组织中的相对表达量明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义(t=216.31、-10.97，P<0.05)。

N：癌旁组织；C：宫颈癌组织。

3 讨论

宫颈癌的发生和发展受多种因素的影响，目前认为其与早婚早孕、性生活紊乱、经济状况和环境因素等有关[5]。近年来，随着分子生物学的发展，宫颈癌的研究进入到分子和基因水平。研究发现，基因调控着宫颈癌的发生和发展[6-7]，而这些基因的转录和翻译也受到多方面因素的调控。其中，miRNA的调控是转录后调控的重要方法。

MiRNAs能够特异性地与mRNA的3′非编码区域结合，降解mRNA，从而抑制靶基因的蛋白表达，属于转录后调控的重要组成部分。在肿瘤的发生和发展中，多种miRNAs发挥重要作用，其中有的miRNA发挥癌基因作用，能够促进肿瘤的生长、增殖和浸润，而有的miRNA发挥抗肿瘤作用，抑制肿瘤的生长和转移[8]。

miR-144-3p在多种生理和病理过程中均发挥重要的作用。miR-144-3p在脂质代谢尤其是胆固醇的逆行转运中发挥重要作用[9]，在多种肿瘤的发展和转移中也发挥重要作用。有研究发现，miR-144-3p在脑胶质细胞瘤瘤体组织和细胞系中的表达量均明显降低，且其表达和预后相关；miR-144-3p的表达量越低，患者的中位生存率越短，多因素回归分析证实，miR-144-3p的低表达水平是预后差的独立危险因素；通过生物信息学预测这可能是通过抑制卷曲蛋白7来实现的[10]。miR-144-3p在胰腺癌肿瘤组织和细胞系PANC-1中的表达均明显降低，而脯氨酸富含蛋白11(proline-rich protein 11，PRR11)的表达量明显升高；在细胞中的研究发现，用miR-144-3p类似物能够使细胞周期阻滞在S期而抑制细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，而用其抑制剂能够逆转miR-144-3p的作用；荧光素酶活性检测发现，miR-144-3p能够直接和PRR11的3′非翻译区相结合，从而抑制其发挥作用[11]。细胞实验证实，miR-144-3p能够抑制激活蛋白-1转录因子的亚基FOSB基因的表达，从而抑制胰腺癌细胞的增殖、浸润和转移[12]。在肾癌细胞中的研究发现，miR-144-3p的表达量均明显降低；miR-144-3p能够抑制细胞的增殖和进展，而且能够抑制上皮-间质转化从而抑制细胞的浸润[13]。而在肾透明细胞癌中的研究发现，miR-144-3p的高表达能够促进肿瘤的增殖和浸润，手术后患者的miR-144-3p表达水平较术前明显降低[14-15]。本研究发现，miR-144-3p在宫颈癌组织中的表达量明显低于癌旁组织，而且与肿瘤的淋巴结转移有关。

NFE2L2是调控细胞内氧化-还原机制的重要转录因子，由NFE2L2基因编码，在体内生理及病理过程中发挥重要的调节作用[16]。NFE2L2的突变会导致体内氧化-还原系统失衡，在多种肿瘤的发生和发展中起重要作用。在恶性黑色素瘤的研究中发现，NFE2L2的表达增高和Keleh样环氧氯丙烷相关蛋白-1表达降低在转移癌患者中更多见，而且可能与上皮-间质转化有关[17]。而在乳腺癌患者的研究中发现，NFE2L2 mRNA低表达患者的预后较差[18]。有研究发现，NFE2L22在宫颈鳞状细胞癌组织的表达量明显高于宫颈上皮内瘤变和正常宫颈组织；体外实验发现，抑制NFE2L2的表达后，肿瘤细胞的增殖和浸润明显受到抑制[19]。本研究结果证实，宫颈癌组织中NFE2L2的表达量明显高于癌旁组织。

本研究证实，宫颈癌组织中miR-144-3p的表达量明显降低，且和患者的转移及浸润程度有关，说明miR-144-3p可能作为判断宫颈癌恶性程度的指标；而NFE2L2在宫颈癌组织中的表达量明显升高，提示miR-144-3p的低表达降低了其对NFE2L2的抑制作用，进而促进肿瘤的发生，但是其具体的机制尚需要进一步通过分子生物学方式进行验证。