亚低温治疗对缺氧缺血性脑病新生儿白细胞介素-17和调节性T细胞水平的影响

王倩楠，唐成和，石计朋，尚 云

(新乡医学院第一附属医院新生儿科，河南 卫辉 453100)

缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE) 是围产期多种原因造成缺氧与脑血流减少而引起的新生儿脑部受损[1]，导致高病死率和长期神经功能障碍。亚低温治疗是唯一被证明对HIE有确切疗效的方法，一般认为出生后6 h内为最佳的治疗时间窗[2]。临床上许多HIE患儿错过了最佳治疗时机，对该类患儿应用亚低温治疗是否仍有脑保护作用，临床认识尚不统一。同时免疫炎症在HIE中的作用日益受到重视，因此本研究以出生后6～12 h的HIE患儿为研究对象，通过观察治疗前后新生儿神经行为测定(neonatal behavioral neurological assessment，NBNA)评分及外周血 调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)和白细胞介素-17(interleukin 17，IL-17)表达的变化，探讨延长亚低温治疗时间窗的可行性及免疫炎症在其中的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2015年11月至2017年9月新乡医学院第一附属医院新生儿科收治的中、重度HIE患儿为研究对象。纳入标准：(1)所有患儿均符合HIE诊断标准[3]；(2)均在出生后 6～12 h内入院治疗，出生体质量2.5～4.0 kg，37周≤胎龄<42周；(3)出生后1 min Apgar评分≤3，5 min Apgar评分≤5。排除标准：(1)严重先天畸形；(2)颅脑创伤或中、重度颅内出血；(3)血小板<50×109L-1；(4)严重感染性疾病等。该研究共纳入HIE患儿39例，根据患儿治疗方法不同分为亚低温组和对照组。对照组18例，男10例，女8例；胎龄37.0～41.2(38.4±1.3)周；出生体质量1.63～4.05(3.22±0.61)kg；中度HIE 10例，重度HIE 8例。亚低温组21例，男12例，女9例；胎龄37.0～41.0(38.7±1.2)周；出生体质量2.50～4.39(3.26±0.60)kg；中度HIE 12例，重度HIE 9例。2组患儿的性别、胎龄、出生体质量和病情程度比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过医院医学伦理委员会批准，患儿监护人均签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器流式细胞分析用溶血素、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的鼠抗人CD4、别藻青蛋白(allophycocyanin，APC)标记的鼠抗人CD25、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的鼠抗人CD127、人Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒和流式细胞仪均购自美国BD公司。

1.3治疗方法对照组患儿采用常规支持治疗，如纠正低血压、低氧血症和代谢性酸中毒等。亚低温组患儿在常规支持治疗的基础上加用全身亚低温治疗，患儿尽量裸露并远离一切加温设施，置于自动调控的冰毯上，开始诱导降温时速度要快，要求在 1～2 h达到目标温度，将直肠温度控制在33.5～34.5 ℃，持续治疗72 h，随后给予自然复温，一般复温速度为每2 h升高1 ℃，至少持续6 h后再恢复到正常体温。亚低温治疗期间密切观察患儿的神经系统表现，动态监测患儿血压、呼吸、电解质和凝血功能等。如果在此过程中出现严重不良反应则立即终止亚低温治疗。

1.42组患儿血Treg细胞检测治疗前及治疗 72 h 后抽取各组新生儿静脉血1 mL于抗凝采血管中，24 h 内完成检测；上样管中加入CD4、CD25和CD127抗体各3 μL，全血40 μL，混匀后避光孵育15 min；加入1 mL溶血素，混匀后避光静置15 min；3 000 r·min-1离心5 min；弃上清液后加入1 mL鞘液洗涤2次；0.5 mL鞘液重悬后用流式细胞仪检测。以CD4+细胞设门，分析CD4+CD25+CD127lowTreg细胞占CD4+细胞的百分比[4]。

1.52组患儿血IL-17水平检测治疗前及治疗72 h后抽取各组患儿外周静脉血1 mL置于含有促凝剂的采血管中，待血液凝固后 3 000 r·min-1离心 5 min，取40 μL血清，依照试剂说明书方法处理样本，用流式细胞仪检测细胞因子，结果用FCAP Array软件分析。

1.6新生儿神经功能评价入组患儿均采用NBNA评分，于出生后14、28 d，以20项新生儿行为神经测查法为标准，从行为能力、被动肌张力、主动肌张力、原始反射和一般评估等5个方面进行测评，满分为40分，≥35分表示患儿的行为神经功能正常，<35分表示新生儿的行为神经功能异常。

2 结果

2.12组患儿血Treg细胞及IL-17水平比较结果见表1。治疗前，亚低温组与对照组中、重度HIE患儿血Treg细胞、IL-17水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗72 h后，对照组中、重度HIE患儿及亚低温组重度HIE患儿血Treg细胞、IL-17水平与治疗前比较差异均无统计学意义(P>0.05)。亚低温组中度HIE患儿血Treg细胞水平显著高于治疗前及对照组中度HIE患儿，IL-17水平显著低于治疗前及对照组中度HIE患儿，差异均有统计学意义(P<0.05)；亚低温组重度HIE患儿血Treg细胞、IL-17水平与对照组重度HIE患儿治疗后比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 2组患儿治疗前后血Treg细胞及IL-17水平比较Tab.1 Comparison of the levels of peripheral blood Treg cell and IL-17 between the two groups before and after treatment

2.22组患儿NBNA评分比较结果见表2。出生后14、28 d，亚低温组中度HIE患儿的NBNA评分显著高于对照组中度HIE患儿，差异有统计学意义(P<0.05)；亚低温组与对照组重度HIE患儿的NBNA评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 2组患儿不同时间NBNA评分比较Tab.2 Comparison of NBNA score between the two groups at different time

3 讨论

亚低温治疗HIE有显著的神经保护作用[5]，Meta分析已证实，亚低温能显著降低足月HIE患儿的病死率和远期神经系统疾病发生率[6]。许多国家已将亚低温治疗列为新生儿HIE的常规治疗方法，有效降温也已列入新生儿窒息复苏后的常规管理办法[2]。亚低温干预的最佳时期是在出生后 6 h 之内，但临床上有部分患儿由于各种原因错过了最佳的治疗时机。LI等[7]研究认为，出生后6～10 h 开始亚低温治疗是有效的。也有研究发现，延迟至6～12 h开始亚低温治疗可能仍有效[8-9]。最近美国一项多中心临床研究发现，HIE患儿生后6～24 h开始亚低温治疗可以降低患儿18个月内死亡或残疾的风险，但最终指出效果仍不确定[10]。这些研究表明，超过最佳治疗时间窗进行亚低温治疗也有一定的脑保护作用，但目前尚存在争论。本研究结果显示，出生后14、28 d，亚低温组中度HIE患儿NBNA评分较对照组中度HIE患儿高，而2组之间重度HIE患儿NBNA评分比较差异无统计学意义，提示中度HIE患儿出生后6～12 h行亚低温治疗可能仍然有效，而对重度HIE患儿效果不明显，这可能是因为严重的缺氧缺血导致在亚低温治疗介入前二次能量衰竭已经发生。

免疫反应和炎症在新生儿HIE中发挥了重要作用[11]。缺氧缺血引起血管内炎症级联反应，同时应激或死亡的神经元引起脑固有免疫细胞的活化以及外周免疫细胞的脑浸润，这些免疫细胞通过释放神经毒性物质(如活性氧和炎性细胞因子等)最终导致了继发性神经元死亡[12]。亚低温治疗不仅可以减少脑细胞的代谢率，还能抑制免疫反应，进而起到神经保护作用[13]。Treg细胞通过细胞间的直接接触和分泌细胞因子来发挥抗炎作用。Treg细胞能有效抑制自身免疫反应，是维持免疫稳态和限制炎性损伤的关键因素[14]。IL-17主要由Th17细胞分泌，炎症早期许多固有免疫细胞也能迅速分泌IL-17，是典型的促炎细胞因子。IL-17通过活化丝裂原活化蛋白激酶途径和核转录因子-κB途径促进促炎性分子的产生，进而导致损伤部位炎性细胞浸润和坏死[15]。在免疫炎症反应中，存在Treg/Th17失衡[16]。在缺血性脑卒中患者中，存在IL-17升高和Treg细胞降低[17-18]。有研究表明，在新生儿HIE中，脑损伤程度与外周血中IL-17水平呈正相关，与Treg细胞水平呈负相关[19]。本研究结果显示，治疗72 h后，各组HIE患儿血Treg细胞均较治疗前升高，IL-17水平均较治疗前降低，但仅亚低温组中度HIE患儿治疗后血Treg细胞及IL-17水平与治疗前及对照组比较差异有统计学意义，因此，6～12 h开始亚低温治疗可能通过维持较高的Treg细胞比例调节免疫反应抑制炎症，同时通过抑制IL-17等促炎性细胞因子及其诱导的炎症级联反应来降低脑损伤，但在重度HIE患儿中这一效果并不明显。

综上所述，亚低温治疗对出生后6～12 h的中度HIE患儿仍具有脑保护作用，通过刺激Treg细胞的生成和抑制促炎性细胞因子IL-17发挥脑保护作用。由于本研究观察时间短、样本量较少，后期需要纳入更多的样本及延长观察时间，来观察延长亚低温治疗时间窗的疗效与安全性，以使更多的患儿受益于亚低温治疗。