免疫性血小板减少症患儿外周血中DNA甲基转移酶蛋白表达及临床意义

郭路阳，范 蕊，肖爱菊，曹丽佳，石太新，赵东菊，李培岭

(1.新乡医学院第一附属医院儿科，河南 卫辉 453100；2.安阳市妇幼保健院儿科，河南 安阳 455000)

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenic，ITP)是儿童常见的出血性疾病之一，具有自限性[1]。其发病主要原因是细胞和体液免疫介导的血小板过度破坏、巨核细胞数量和质量异常导致血小板生成不足[2]。近年来，学者对自身免疫性疾病、肿瘤及心脑血管疾病的表观遗传学进行了大量研究，尤其是在DNA甲基化、DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)方面[3-4]。DNMT是催化并维持DNA甲基化过程的一类酶。有研究表明，DNMT的异常表达与自身免疫性疾病等密切相关，DNA甲基化水平的改变可以影响T细胞基因表达，从而改变免疫功能，促进狼疮样疾病和其他形式的自身免疫性疾病的发展[5]。本课题组前期已进行了急性、持续性及慢性ITP患儿外周血淋巴细胞的DNMT mRNA表达的研究[6-7]。本研究通过检测血清中DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白的表达情况，进一步探讨DNMTs在儿童ITP中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2015年5月至2016年5月于新乡医学院第一附属医院就诊的新诊断急性ITP患儿60例作为观察组，其中男34例，女26例，年龄为1个月4天至12岁，平均(37.4±31.5)个月；根据文献[8]将患儿分为<1岁组、1～5岁组和>5岁组。入选标准：(1)符合新诊断ITP诊断标准[2]；(2)经骨髓细胞学检查证实为ITP；(3)年龄<14岁。排除标准：(1)其他原因引起的继发性血小板减少；(2)有明确感染病因或药物接触病史；(3)4周内有输血史、糖皮质激素及疫苗接种史；(4)4周内有应用维生素B12、B6及叶酸史。选择同期于新乡医学院第一附属医院进行健康体检的正常儿童36例作为对照组，其中男25例，女11例，年龄为1个月27天至12岁3个月，平均(33.5±16.0)个月。对照组入选标准：(1)2周内无感染史；(2)4周内无糖皮质激素、输血及疫苗接种史；(3)4周内未应用维生素B12、B6及叶酸。2组儿童年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准，血液标本采集获得患儿家属的知情同意。

1.2方法观察组患者于就诊当日、对照组受试者于体检当日无菌采集静脉血2 mL，静置20～30 min，3 000 r·min-1离心20 min，收集血清并分装至EP管中，-80 ℃冰箱存储备检。采用酶联免疫吸附测定法检测2组受试者血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白的表达水平，实验过程严格按照说明书进行操作，试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。

2 结果

2.12组受试者血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表达水平比较结果见表1。观察组患儿血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表达水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 2组受试者血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表达水平比较Tab.1 Comparison of the expression of DNMT1，DNMT3a and DNMT3b protein in serum between the two groups

2.2观察组不同年龄段患儿血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白水平比较结果见表2。不同年龄段患儿血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 观察组不同年龄段患儿血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表达水平比较Tab.2 Comparison of the expression of serum DNMT1，DNMT3a and DNMT3b protein in children of different age in the observation group

2.3观察组不同性别患儿血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白水平比较结果见表3。男性与女性患儿血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 不同性别患儿血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表达水平比较Tab.3 Comparison of the expression of DNMT1，DNMT3a and DNMT3b protein in serum between male and female children in observation group

2.4观察组患儿血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表达水平的关系Pearson相关分析结果显示，观察组患儿血清DNMT1与DNMT3a、DNMT3b蛋白表达水平无相关性(r=-0.025、-0.057，P=0.851、0.665，P>0.05)；DNMT3a与DNMT3b蛋白表达水平呈正相关(r=0.259，P=0.046)

3 讨论

随着分子生物学的发展，表观遗传学逐渐成为一个新的研究领域。表观遗传学强调的是细胞核的遗传不依赖于DNA碱基序列的改变[9]，此种表型变化具有可逆性，为疾病的治疗及预防提供了一种可能性。DNMT是催化DNA甲基化的重要生物酶，DNMT的异常激活与表达可导致DNA的甲基化异常。DNMT主要有DNMT1、DNMT3a和DNMT3b，DNMT1的主要作用是维持DNA甲基化，DNMT3a和DNMT3b主要负责从头甲基化[10]。

DNMT的低表达可导致DNA低甲基化，从而在T淋巴细胞的激活、炎性因子的释放、激活自身免疫反应等过程中发挥作用，进而参与了ITP的发病[11]。有学者对ITP患儿外周血全局表达谱进行了分析，结果显示，与ITP相关的几种基因在系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎中亦有表达，这表明ITP与其他自身免疫性疾病的发病有关联[12]。亦有研究发现，在ITP的DNMT3b基因启动子中，白细胞介素-1受体1型(interleukin-1 receptorⅠ，IL1R1)内含子-2和rs2424913单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)(C46359T)相关联，IL1R1可变串联重复多态性和rs2424913 DNMT3B SNP在儿童期ITP中有较高的频率，这些遗传标志物的出现提示DNMT可能参与了ITP的发病[13]。

ITP是自身免疫性疾病，病因仍不清楚，国内外学者研究发现，在成人ITP的发病中存在着DNA低甲基化[14]，而DNMT是催化DNA甲基化的关键生物酶，但关于DNMT与儿童ITP的关系，目前相关研究不多。本课题组前期已进行了急性、持续性、慢性ITP患儿外周血淋巴细胞中DNMT mRNA表达的研究，结果显示，ITP患儿外周血淋巴细胞可能存在DNA低甲基化模式[6-7]。本研究进一步检测ITP患儿外周血清中DNMT的蛋白表达水平，结果发现，新诊断ITP患儿血清中DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表达水平明显低于对照组，提示新诊断ITP患儿可能存在DNMT低表达。但引起其低表达的具体原因尚不清楚，考虑某些因素如感染等作用于DNMT，使其表达下降，进而引起DNA低甲基化，从而引起白细胞介素6、淋巴细胞功能相关抗原等体内相关细胞因子表达增加，导致体内免疫紊乱，参与ITP的发病。有研究发现，DNMT的表达量和活性的改变均参与调控DNA甲基化水平[15]。因此，考虑DNMT对DNA甲基化的调控作用主要是通过与启动子的结合、DNMT酶的含量及活性的改变等作用而实现的。

DNA甲基化及DNMT在人的生长发育中是动态变化的，并且起着重要作用[16]。DELSANTE等[17]研究发现，DNMT1的表达与年龄有关，XU等[18]研究显示，DNA甲基化水平随着年龄的增长呈下降趋势。另有研究发现，慢性ITP的发生与初诊时的年龄有关，初诊时发病年龄越大，进展为慢性ITP的可能性就越大[8，19]。但亦有研究发现，风湿性心脏病患者中DNMT的表达与年龄无明显相关性[20]。总之，关于年龄与DNMT表达的关系目前的研究结果尚不一致。本研究对患者初诊时的年龄进行分析，结果显示，不同年龄段患儿血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表达水平比较差异无统计学意义，与上述研究结果存在不一致的原因可能为年龄分组范围不一致、样本量较少、个体差异等。

既往有研究认为，DNA甲基化水平在性别间无差异[21-22]。亦有研究发现，女性DNA甲基化水平低于男性[23]，还有研究认为，DNMT3b蛋白表达水平在不同性别中差异有统计学意义[24]。本研究结果显示，新诊断ITP患儿血清DNMT蛋白表达水平在男、女患儿间比较差异无统计学意义。

在自身免疫性疾病、肿瘤、胚胎发育及心脑血管疾病中，DNMT表达异常可通过多途径参与发病[25]。机体正常DNA甲基化状态的维持是通过DNMT家族相互协调、共同维持，而不是单独发挥作用[26]。有研究发现，在结肠癌细胞中[27]，当敲除DNMT3b基因时，仅可降低3%的甲基化水平，同时敲除DNMT1和DNMT3b后，则可降低95%的甲基化水平。本研究结果显示，新诊断ITP患儿血清DNMT3a与DNMT3b存在正相关关系，推测在ITP患儿DNA甲基化过程中DNMT3a与DNMT3b存在相互协调作用，但其在促进甲基化中的作用是微弱的；而DNMT1与DNMT3a、DNMT1与DNMT3b蛋白表达之间均无相关性，可能是因为该疾病为自限性良性疾病，有自愈转归的可能。

综上所述，ITP患儿血清DNMTl、DNMT3a及DNMT3b蛋白表达水平降低，可能通过参与低甲基化，进而参与了儿童ITP的发病。在儿童ITP的DNA甲基化过程中，DNMT可能起一定的协同作用，但DNMT作为DNA甲基化的关键酶，其活性降低亦可导致DNA甲基化水平降低，故还需对DNMT的活性做进一步研究。