小麦不同器官表皮蜡质的组分及晶体结构分析

赵 帅，罗文巧，王 聪，吴洪启，汪 勇，王中华,权 力

(西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

植物表皮蜡质是覆盖在植物表面与外界环境之间的一层疏水性保护屏障，主要由超长链脂肪酸及其衍生物如脂肪酸、烷烃、初级醇、醛、二酮和酯等化合物组成[1]，可以起到防止水分的非气孔性散失，进而增强植物抵御干旱的能力[2]。除此之外，表皮蜡质在植物抵抗病菌入侵、昆虫吞食[3]以及紫外辐射、霜冻伤害[4-5]等生物和非生物胁迫中也表现出重要的作用。表皮蜡质的晶体结构会因物种的不同或同种植物的器官不同，而表现出不同的类型，蜡质晶体的结构主要有柱状、片状、管状、线状等，并且蜡质晶体结构的差异主要由构成蜡质晶体的化学成分决定，片状晶体主要含有初级醇等成分，而管状晶体通常含有大量的 β-二酮[6]。同时，蜡质含量较高的植物表面往往呈白霜状表型[7-8]。

小麦作为我国主要的粮食作物之一，其产量受到干旱、虫害、病害等生物胁迫和环境胁迫的严重影响。近年来，大量关于植物表皮蜡质以及其植物生物学功能的研究表明，植物表皮蜡质对植物的生长发育有很大的影响[9-10]。在大麦的颖壳和叶片的表皮蜡质成分中，颖壳的烷烃和二酮含量占比相对于叶片明显升高[11]。对小麦的研究也表明，烷烃和二酮在颖壳表皮蜡质组分中占有较大比例，而在叶片表皮蜡质组分中初级醇占有绝对优势[12]。随着小麦的生长发育，叶片的表皮蜡质成分中烷烃和二酮的比例大幅提高，并且随着生长进程的推进而继续增加，但初级醇仍占据主导地位[12]。这些研究尽管对小麦一些器官的表皮蜡质进行测定和分析，但仅选取了部分器官的表皮蜡质，缺乏整体性。目前，对小麦不同器官整体蜡质组分和含量的相关研究较少。本研究选取表皮蜡质表型存在明显差异的两个小麦品种泰山4447和济麦6097，对其7个不同器官的表皮蜡质组分进行测定，利用扫描电镜观察蜡质晶体结构，通过比较小麦不同器官的表皮蜡质组分和晶体结构差异，并结合失水率检测分析表皮蜡质对叶片中水分的非气孔性散失产生的影响，以期为揭示小麦蜡质的合成机理以及蜡质成分与抗逆性的关系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试材料为表皮蜡质表型存在明显差异的两个小麦品种泰山4447(绿色表型)和济麦6097(白霜状表型)。试验材料种植于西北农林科技大学西区科研试验田，在小麦抽穗期采集穗部、叶鞘、穗下茎、旗叶、倒二叶、倒三叶和倒四叶七个器官的表皮蜡质进行气相色谱分析、扫描电镜观察和生理指标检测。

1.2 方 法

1.2.1 蜡质的提取

将一定样品置于装有25 mL三氯甲烷的50 mL玻璃烧杯中45 s，操作中轻轻摇晃烧杯加速蜡质溶解，而后加入20 μL C24烷烃作为内标并将烧杯放置于通风厨中室温蒸发。待三氯甲烷挥发完全后，重新加入5 mL三氯甲烷溶解并用胶头滴管转入15 mL样品瓶，而后置于通风厨中室温静置蒸发。待挥发完全后重新加入1 mL三氯甲烷并用漏斗过滤到GC样品瓶中。三氯甲烷挥发完全后分别加入20 μL吡啶和20 μL双(三甲基硅烷基)三氯乙酰胺[Bis-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide]，密封后放入70 ℃水浴锅中衍生反应1 h。反应完全后用氮气恒温吹干仪(70 ℃)吹干GC样品瓶后重新加入1 mL三氯甲烷溶解蜡质，最后使用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS-QP2010,日本岛津公司)和气相色谱仪(GC/FID-2010PLUS，日本岛津公司)分析蜡质成分。每个样品设三个重复。

1.2.2 蜡质组分及含量测定

利用气相色谱-质谱联用仪 (GC-MS) 检测小麦各个器官表皮蜡质成分的离子峰，然后检索质谱数据库(http://metlin.scripps.edu/index.php)鉴定表皮蜡质中各种化合物后得到标准样品图。利用气相色谱-火焰离子化检测仪 (GC-FID) 检测蜡质成分的离子峰，使用LabSultion软件积分后获得峰面积，以内标的峰面积为标准分别对各种化合物定量分析。气相色谱-质谱联用仪 (GC-MS) 和气相色谱-火焰离子化检测仪 (GC-FID) 的检测条件为：标准进样量为1 L，设置进样口温度为280 ℃，调整分流比为5∶1，检测器温度为320 ℃；检测程序如下：50 ℃保持2 min，以20 ℃· min-1升温至240 ℃保持2 min，1.5 ℃· min-1升温至320 ℃保持15 min。计算蜡质中各组分的相对含量。

相对含量=各组分离子峰面积/总离子峰面积

1.2.3 蜡质晶体观察

将小麦各个器官的样品用回形针分别固定在硬纸板上，将固定好的样品放置在50 ℃烘箱中干燥备用。提前将导电胶粘贴在托盘上，将完全干燥的各个样品切成2 mm×2 mm的正方形小块，粘贴在导电胶上，抽真空后镀金(E-1045,Hitachi)制样,最后在场发式扫描电子显微镜(S-4800,Hitachi)上观察各部位表皮蜡质的晶体结构。

1.2.4 叶片失水率检测

选取抽穗期离体旗叶叶片(3片叶片为一组，设置3个重复)，将样品放置黑暗环境中1 h使叶片上气孔完全关闭，取出叶片后立即用千分之一天平称重并计时，该质量为原始质量，时间点为0 h，而后分别在0.5、1、2、3、4、5和 6 h时间点称重。各时间点的失水率为原始质量与各时间点处样品质量之差与原始质量的比值。

1.3 数据分析

使用Excel 2007对数据进行整理，用DPS v 7.05软件对数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 小麦不同器官表皮蜡质组分及其相对含量的差异

GC-MS和GC-FID分析结果显示，两小麦品种不同器官的表皮蜡质主要包含初级醇、脂肪酸、脂肪醛、烷烃、二酮、酯等脂肪族化合物(表1)。两品种叶片表皮蜡质中初级醇的含量最高，相对含量为45.30%～76.87%。两品种的颖壳表皮蜡质中二酮含量最高，相对含量分别为58.38%和84.21%。泰山4447的穗下茎和叶鞘表皮蜡质中烷烃相对含量最高，相对含量分别为50.04%和40.18%；二酮次之，相对含量分别为25.83%和26.56%。而济麦6097的穗下茎和叶鞘表皮蜡质中二酮含量最高，相对含量分别为55.20%和 44.94%；烷烃次之，相对含量分别为28.03%和29.54%。这说明两个品种表皮蜡质的组分一致，二者在各个器官中二酮和初级醇含量差异显著，济麦6097穗部、穗下茎和叶鞘等器官的表皮蜡质中二酮含量显著高于泰山4447，而初级醇的含量则相反。

表1 泰山4447和济麦6097不同器官中蜡质组分及其相对含量Table 1 Wax components and their relative contents on different organs of Taishan 4447 and Jimai 6097 %

表2 泰山4447和济麦6097不同器官表皮蜡质的碳链长度分布Table 2 Carbon chain length distribution of wax on different organs of Taishan 4447 and Jimai 6097 %

同一行数据后不同大、小字母分别表示不同器官中蜡质相同组分在0.01和0.05水平差异显著。TS：泰山4447；JM：济麦6097。
Different capital and small letters following the values in same line indicate significant differences among different carbon chain length of components at 0.01 and 0.05 levels,respectively.TS：Taishan 4447;JM:Jimai 6097.

2.2 小麦不同器官表皮蜡质各组分链长的分布

经对两小麦品种七个器官表皮蜡质的GC-MS分析和质谱数据库检索，一共鉴定出29种脂肪族化合物。初级醇主要是链长分布为C20～C32的偶数碳链醇；脂肪酸主要是链长分布在C20～C28的偶数碳链酸；脂肪醛主要是链长分布C22～C28的偶数碳链醛；烷烃主要是链长分布为C23～C33奇数碳链烷烃；二酮的碳链长度为C31，包含 β-二酮和OH-β-二酮两种化合物及其同分异构体；酯是主要链长分布为C40～C48偶数碳链酯(表2)。

在不同器官表皮蜡质所含的初级醇中，C28醇相对含量在两品种泰山4447和济麦609叶片表皮蜡质中占有绝对优势，相对含量分别为38.50%～69.00%和40.01%～70.95%。在不同器官表皮蜡质所含的烷烃中，C31烷烃的相对含量最高，在泰山4447和济麦609中分别为5.49%～25.09%和3.52%～14.59%，且在泰山4447各个器官中的相对含量均高于济麦6097。在两个小麦品种不同器官表皮蜡质所含的二酮中，泰山4447的旗叶、穗下茎、叶鞘和颖壳中β-二酮含量与济麦6097差异显著，其中泰山4447和旗叶表皮蜡质、穗下茎和叶鞘中β-二酮含量分别为11.38%、23.80%和24.93%，在济麦6097中分别为18.77%、40.24%和48.80%。两个品种的脂肪族化合物链长一致，而含量差异主要体现在β-二酮。济麦6097的表皮蜡质中β-二酮的相对含量显著高于泰山4447。小麦各器官中表皮蜡质中脂肪酸、脂肪醛和酯相对含量较小，因而这些化合物碳链的占比也较少。

2.3 小麦不同器官表皮蜡质的晶体结构

从扫描电镜观察结果看，泰山4447和济麦6097各器官蜡质晶体结构存在明显的差异，其中两品种的旗叶近轴面(图1A、1E)、倒二叶(图1C、1D、1G、1H)、倒三叶(图1I、1J、1M、1N)和倒四叶(图1K、1L、1O、1P)的蜡质晶体均呈现片状结构；旗叶远轴面(图1B、1F)的蜡质晶体均呈现管状结构；穗下茎(图1R、1U)和叶鞘(图1S、1V)的蜡质晶体均呈管状结构；差异明显的是泰山4447的颖壳蜡质晶体结构表现出管状和片状共存(图1Q)，而济麦6097的颖壳蜡质晶体则为单一管状结构(图1T)。

2.4 小麦品种旗叶的失水率差异

检测结果显示，泰山4447和济麦6097的离体旗叶失水率均随时间的增加呈明显增加趋势，在离体10 h至30 h两个品种差异显著，其中泰山4447和济麦6097在离体30 h时的失水率分别为75.4%和68.2%(图2)，说明泰山4447的旗叶水分非气孔性散失快于济麦6097。

图2 泰山4447和济麦6097旗叶的失水率Fig.2 Water loss rate of flag leaves of Taishan 4447 and Jimai 6097

3 讨 论

植物表皮蜡质会因物种、组织器官及生长发育的不同而存在较大差异，同时会受到光照、温度等环境的影响[5]。本研究通过GC-MS和GC-FID测定了两个小麦品种抽穗期不同器官表皮蜡质的成分及含量，通过电镜观察各个器官表皮蜡质晶体结构。结果表明，泰山4447和济麦6097的表皮蜡质主要由29种化合物组成，包含7种初级醇、5种脂肪酸、4种脂肪醛、6种烷烃、5种酯和2种二酮。不同器官之间表皮蜡质成分相似，但各成分相对含量存在显著差异。汪 勇等[9,14]研究中发现，小麦叶片表皮蜡质中烷烃的占比最高，穗和鞘等器官表皮蜡质中二酮的占比最高。本研究中两小麦品种在旗叶、倒二叶、倒三叶和倒四叶中烷烃含量最高,初级醇的含量次之，其中白霜状表型济麦6097的穗下茎、穗部和叶鞘中二酮含量最高，绿色表型泰山4447在颖壳表皮蜡质中二酮含量最高，但是在鞘和穗下茎表皮蜡质中烷烃含量高于二酮含量，且三个器官表皮蜡质中二酮含量与济麦6097相比显著降低。Adamskin等也认为，白霜状表型小麦表皮蜡质中含有大量的二酮[12]。本研究中，绿色表型济麦6097的颖壳、叶鞘和穗下茎外观可见明显的白霜，而倒二叶、倒三叶和倒四叶则没有，二酮含量的差异可能是导致了不同器官表皮蜡质表型不同的主要原因。因此，济麦6097和泰山4447表皮蜡质表型的差异也很可能由二酮的含量决定。植物蜡质层由填充于角质内的内层蜡质和覆盖于角质层外的外层蜡质组成，一般内层蜡质呈无定形态，而外层蜡质会形成蜡质晶体堆积在角质层外，并受到蜡质成分和环境的影响[15]。在二穂短柄草[16]和节节麦[17]等植物叶片蜡质中因含有大量的初级醇而呈现出片状晶体结构，而蜡质柱状晶体含有大量的β-二酮、初级醇等化合物[6]。在本研究中，两个小麦品种倒二叶、倒三叶、倒四叶、旗叶近轴面的蜡质晶体呈整齐的片状结构，而倒二叶、倒三叶、倒四叶、旗叶近轴面的蜡质成分中初级醇的含量占比最高；旗叶远轴面的蜡质晶体呈管状结构，旗叶远轴面的蜡质成分中二酮含量占比最高；穗下茎和叶鞘的蜡质晶体结构呈管状，同时其蜡质成分中二酮含量占比最高，泰山4447的颖壳蜡质晶体出现片状与管状共存的现象，而济麦6097的颖壳蜡质只有管状晶体，这可能与其穗部蜡质成分中含有较高的初级醇有关。

A和E:泰山4447和济麦6097旗叶的近轴面；B和F：泰山4447和济麦6097旗叶的远轴面；C和G：泰山4447和济麦6097倒二叶近轴面；D和H：泰山4447和济麦6097倒二叶远轴面；I和M：泰山4447和济麦6097倒三叶近轴面；J和N：泰山4447和济麦6097倒三叶远轴面；K和O：泰山4447和济麦6097倒四叶近轴面；L和P：泰山4447和济麦6097倒四叶远轴面；Q和T：泰山4447和济麦6097颖壳；R和U：泰山4447和济麦6097穗下茎；S和V：泰山4447和济麦6097叶鞘。A and E:Adaxial surface of flag leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; B and F:Abaxial surface of flag leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; C and G:Adaxial surface of top second leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; D and H:Abaxial surface of top second leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; I and M:Adaxial surface of top third leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; J and N:Abaxial surface of top third leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; K and O:Adaxial surface of top fourth leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; L and P:Abaxial surface of top fourth leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; Q and T:Glume surface of Taishan 4447 and Jimai 6097; R and U:Peduncle surface of Taishan 4447 and Jimai 6097; S and V:Leaf sheath surface of Taishan 4447 and Jimai 6097.

小麦器官表皮蜡质的合成与环境胁迫有着密切联系。蜡质合成相关基因通过调控蜡质合成调整植物的抗逆性[14]；在拟南芥中 CER1基因的过表达可以提高蜡质成分的合成，进而拟南芥的抗逆性[18]； SLCER6基因参与蜡质合成中超长链脂肪酸的延伸，在番茄突变体中叶片和果实表皮蜡质成分的含量因基因突变而显著减少，使番茄角质层失水率显著增加，进而导致植株不育[19-20]。小麦各器官的蜡质晶体结构和蜡质成分含量与各器官的生物学功能有很大的关系，表皮蜡质中二酮的含量高低可影响植物外观表型[21-22]，白霜状的表型有助于防止植物的非气孔性水分散失，并且蜡质含量与植物的抗旱性呈正相关[23]。本研究对小麦旗叶的生理检测发现，蜡质含量较低的小麦品种旗叶拥有较高的失水效率。电镜观察结果表明，两个品种表皮蜡质结构相似。气相色谱-火焰离子化检测 (GC-FID)发现，两个品种旗叶的蜡质成分并不存在差异，而济麦6097的旗叶相对于泰山4447有较高的蜡质含量，这进一步说明表皮蜡质影响了小麦叶片中水分的非气孔性散失。