白藜芦醇调控miR-34a表达对骨肉瘤MG-63细胞生长、侵袭和自噬的影响*

直彦亮， 张 震， 贺 宪

(1广州市番禺区中医院， 广东 广州 511400；2广州医科大学附属深圳沙井医院， 广东 深圳 518104)

骨肉瘤是一类预后差、致死率高的原发恶性骨肿瘤，在儿童和青少年较为常见[1-2]。化疗和辅助化疗作为主要手段在治疗骨肉瘤取得明显效果，但化疗给患者带来严重的毒副作用，致使患者不能坚持治疗，常导致治疗失败[3]。因而，研究新的诊断标志物及安全有效的治疗药物，对治疗骨肉瘤患者具有重要作用。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)参与调控正常及肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡等生理及病理过程，通过靶向调节特定蛋白发挥生理作用[4-5]。miR-34a 是一类肿瘤抑制基因，可调控p53表达抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡等过程[6-7]。白藜芦醇(resveratrol,Res)是一类天然多酚类物质[8]。诸多研究已证实白藜芦醇主要药理作用表现为抗炎、抗氧化和抗凋亡等[9]，对多种肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。目前已有报道研究白藜芦醇可抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭[3]，但其具体机制是否与miR-34a表达存在调控关系仍不清楚。本研究拟探讨白藜芦醇对miR-34a表达的影响及通过调控miR-34a而影响骨肉瘤MG-63细胞活力、侵袭能力和自噬的作用机制。

材 料 和 方 法

1 主要材料和仪器

人骨肉瘤细胞株MG-63 来自中科院细胞所。DMEM 培养基和Lipofectamine 2000试剂盒(Invitrogen);白藜芦醇(Sigma-Aldrich)；胎牛血清(Gibco)；MTT试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；PCR反转录试剂盒和TaqMan®MicroRNA Assays试剂盒[大连宝生物工程(大连)有限公司]；鼠抗人LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和beclin-1单克隆抗体(CST)；辣根过氧化酶标记的兔抗鼠酶标的 II 抗(碧云天生物科技有限公司)；miR-34a和U6引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。7500型PCR仪(Applied Biosystems)；凝胶成像分析仪(Bio-Rad)。

2 实验方法

2.1细胞培养及分组 MG-63细胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM 培养基培养， 37 ℃、5% CO2环境。当70%～80%细胞融合时，将细胞分为6组，分别给予不同浓度(0、10、20、40、60 和80 μmol/L)白藜芦醇处理细胞48 h后，提取各组细胞RNA和总蛋白。

2.2MTT法检测细胞活力 在96孔板中每孔接种1 000个细胞，每组设 3重复孔，同时设对照孔，相应时点在每孔加入20 μL MTT工作液，37 ℃培养箱4 h后弃去培养液后，加入100 μL DMSO，振荡混匀和瞬时离心，在酶标仪上以490 nm测量各孔吸光度(A)值。

2.3Transwell小室实验检测细胞侵袭能力 加入基质至Transwell上室后培养4 h。用胰酶消化细胞，然后用无血清培养基稀释细胞，往transwell上室均匀加入10 000个(100 μL)细胞悬液，往Transwell下室加入600 μL含血清完全培养基，24 h后移除上室培养液。用棉签轻轻去除上室渗透膜上细胞，PBS洗涤渗透膜下层。后用福尔马林固定15 min。1%结晶紫染色液染色8～10 min，拍照观察染色细胞分布情况。

2.4Western blot检测自噬标志蛋白的表达 根据蛋白提取试剂盒操作步骤提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白总量。根据LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白的分子量，用合适浓度的SDS-PAGE分离，继而转膜和封闭，稀释 I 抗后放置在4 ℃冰箱过夜；用TBST洗涤3次， II 抗孵育60 min后继续TBST洗涤3次，化学发光后采集图像。

2.5RT-qPCR实验 采用TRIzol法提取细胞总mRNA。采用TaqMan®MicroRNA Reverse Transcription kit反转录为cDNA，反应总体系为10 μL。用TaqMan®MicroRNA Assays试剂盒检测miR-34a的表达，以U6作为内参照。miR-34a 的上游引物序列为5’-ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTAG-3’，下游引物序列为5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG-3’，产物为81 bp；U6的上游引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，产物94 bp。每组设3个重复，根据各样本的平均Ct 值，以 2-ΔΔCt表示miRNA相对表达水平，所有反应均在ABI 7500实时定量PCR仪完成。

2.6细胞转染 当细胞融合至70%～80%时，在6孔板中铺6×105个细胞，将细胞分成5组：对照(control)组、miR-34a mimic转染(miR-34a mimic)组、miR-34a mimic阴性对照转染(miR-34a mimic negative control, miR-34a NC)组、白藜芦醇(Res)组和miR-34a mimic转染+白藜芦醇(miR-34a mimic+Res)组。将 miR-34a mimic和阴性对照分别转染至MG-63细胞，室温中放置20 min后，分别加入培养孔，继续孵育4 h。其中对照组不做任何处理；白藜芦醇处理组用60 μmol/L 白藜芦醇处理细胞48 h；miR-34a mimic转染+白藜芦醇组在转染后，更换含有血清的完全培养基，再用60 μmol/L 白藜芦醇处理48 h。转染按照Lipofectamine 2000试剂盒说明，将目的细胞按1×108/L接种在24 孔板中，于第2天使用Lipofectamine 2000将20 nmol miR-34a mi-mics转染目的细胞。提取细胞总RNA进行荧光定量PCR检测miR-34a。提取总蛋白检测自噬标志蛋白的表达，方法同2.4。

3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件分析所有数据，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间数据的比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD法分析，以P<0.05表示差异有统计学意义，所有实验均重复3次以上。

结 果

1 白藜芦醇对骨肉瘤MG-63细胞活力、侵袭力和自噬的影响

MG-63细胞经过不同浓度的白藜芦醇分别处理1、2和3 d。培养2 d后MG-63细胞活力明显降低，侵袭能力随白藜芦醇浓度增加呈逐渐减弱的趋势，而自噬标志蛋白表达明显上调，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1～3。

Figure 1. Resveratrol (Res) reduced the viability of MG-63 cells concentration-dependently. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

Figure 2. Resveratrol (Res) inhibited the invasion ability of MG-63 cells in a concentration-dependent manner. The cells were incubated with Res for 48 h (crystal violet staining, ×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

Figure 3. Resveratrol (Res) increased the ratio of LC3-II/LC3-I and the protein expression of beclin-1 in the MG-63 cells in a concentration-dependent manner. The cells were incubated with Res for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

2 白藜芦醇对骨肉瘤MG-63细胞miR-34a表达的影响

与对照组比较，不同浓度的白藜芦醇处理MG-63细胞后，miR-34a的表达明显上调(P<0.05)，见图4。

Figure 4. The effect of resveratrol (Res) on the expression of miR-34a in the MG-63 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

3 miR-34a转染对骨肉瘤MG-63细胞的活力、侵袭能力和自噬的影响

与miR-34a mimic NC组及对照组比较，miR-34a mimic组(处理48 h)、白藜芦醇处理组(处理48 h)以及miR-34a mimic+白藜芦醇处理组的细胞活力明显降低(P<0.05)，侵袭能力明显减弱(P<0.05)，自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高和beclin-1上调更明显(P<0.05)，且miR-34a mimic+白藜芦醇处理组与单纯miR-34a mimic组和白藜芦醇组相比其抑制细胞活力和侵袭能力的作用更强，自噬程度更明显(P<0.05),见图5～7。

Figure 5. The effect of miR-34a on the viability of the MG-63 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsRes group.

讨 论

骨肉瘤是一类在青少年人群中较为常见的原发恶性骨肿瘤，发病率约逐年增加，因其预后效果差、致死率高，给患者社会带来沉重负担[10]。白藜芦醇是一类来自于天然植物的多酚类物质，具有抗氧化和抗衰老等多种药理作用，能够促进肺癌、胃癌和骨肉瘤等肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖和转移[11]，但在不同肿瘤细胞中表现出不一样的抗肿瘤机制。用白藜芦醇处理骨肉瘤细胞后，发现MMP-2蛋白表达下调[12]。研究发现miR-34a具有抑癌功能，在结直肠癌和骨肉瘤等多种肿瘤细胞中表达下调，而过表达miR-34a可明显抑制肿瘤的增殖、侵袭和迁移能力[13-15]。

白藜芦醇能够影响miRNA的表达，表现出抗肿瘤活性[16]，本研究首先证实不同浓度的白藜芦醇对骨肉瘤MG-63细胞miR-34a表达的影响，结果发现随着白藜芦醇浓度增加，骨肉瘤细胞miR-34a的表达逐渐上调，呈显著剂量效应关系，同时白藜芦醇随着浓度增加促进骨肉瘤细胞自噬和抑制侵袭能力越强，该结果与以往文献报道一致[3]，因此，我们推测白藜芦醇的抗肿瘤作用可能与上调miR-34a表达有关。为深入研究这种内在调控联系，本课题组将miR-34a模拟物与阴性对照分别转染至骨肉瘤MG-63细胞，再用60 μmol/L白藜芦醇处理，检测骨肉瘤MG-63细胞的活力，侵袭能力和自噬的变化。结果显示与未经处理的骨肉瘤MG-63细胞及miR-34a模拟物阴性对照组比较， miR-34a模拟物、白藜芦醇以及miR-34a模拟物+白藜芦醇均可明显抑制MG-63细胞的活力和侵袭，并促进自噬标志蛋白表达上调；但与白藜芦醇组以及miR-34a模拟物组比较，miR-34a模拟物+白藜芦醇组可明显增加白藜芦醇或miR-34a模拟物的抗肿瘤作用，对抗细胞生长和侵袭能力的抑制作用更强，自噬标志蛋白的表达更显著增加，提示白藜芦醇可能通过上调miR-34a抑制骨肉瘤MG-63细胞的生长、侵袭并促进自噬。

Figure 6. The effect of miR-34a on the invasive ability of MG-63 cells (crystal violet staining, ×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsRes group.

Figure 7. The effect of miR-34a on the ratio of LC3-II/LC3-I and the protein expression of beclin-1 in the MG-63 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsRes group.

综上所述，白藜芦醇可能通过上调miR-34a抑制骨肉瘤MG-63细胞的活力、侵袭和自噬等生物学行为，本研究的不足之处在于没有继续研究miR-34a通过调控哪些蛋白表达，从而影响骨肉瘤细胞的增殖、迁移，且这种调控作用是否有其它miRNA参与尚不清楚，需要深入研究。