益肾解毒汤对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织纤维化的影响

费秀丽，于昊新，刘 琨，周锦明，何立群

肾纤维化是不同原因导致肾脏内细胞外基质异常沉积并取代正常肾脏结构的病理生理改变[1]，是慢性肾病必经的病理过程，最终导致肾脏功能丧失。早期干预肾纤维化，将有效阻断终末期肾病的发生。大量研究证实，巨噬细胞浸润是所有肾损伤的重要特点。然而处于静息和非活化状态的巨噬细胞并无损伤作用，所以对巨噬细胞增殖及活化的研究显得更为重要。益肾解毒汤是我院全国基层名老中医周锦明临床治疗慢性肾衰的经验方，临床效果确切。前期临床研究显示[2]，益肾解毒汤能明显减缓慢性肾脏病的进展。本研究采用单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction，UUO）模型，通过观察该方对巨噬细胞表面标志物-ED1、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）、诱生性一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）表达的影响，观察探讨益肾解毒汤通过抑制巨噬细胞增殖活化而起到的抗纤维化作用。

1 材料和方法

1.1 动物 健康成年雄性SD大鼠48只，无特定病原体(specefic pathogen free，SPF)级，8周龄，体质量（200±20） g，由上海西普尔-必凯实验有限公司提供。实验动物许可证号SYXK（沪）2009-0069；实验动物合格证号0124736。由上海中医药大学实验动物中心饲养，12 h光照，45%左右相对湿度，自由饮水，进食标准普通饲料。

1.2 药物及试剂 益肾解毒汤方：生黄芪30 g，生大黄10 g，丹参30 g，生地黄10 g，六月雪30 g，茯苓15 g，山萸肉10 g，黄柏10 g，鹿衔草30 g，淮山药15 g（采购自上海第六人民医院金山分院中药房）。根据以往文献制备方法[3]，浓缩至每毫升含生药2 g。对照药为氯沙坦钾片（商品名为科素亚片），100 mg/片（杭州默沙东制药有限公司生产，药物批号150225）。研成细粉，用生理盐水配成2 mg/mL的混悬液。测试试剂：PCNA（Abcam品牌，货号ab29）、ED1（ThermoFisher品牌，货号PA5-13276），iNOS（ThermoFisher品牌，货号PA5-16855）。

1.3 模型制备与分组给药 48只大鼠按区组随机化分为假手术组、模型组、益肾解毒汤组和氯沙坦组，每组12只。假手术组12只剖开大鼠腹腔，分离出左输尿管，不结扎，分层缝合。36只建立UUO模型：3%戊巴比妥钠按0.15 mL/kg的剂量麻醉，行左侧输尿管结扎术。假手术组、模型组予以生理盐水1 mL/d灌胃。益肾解毒汤组和氯沙坦组分别给予益肾解毒汤及对照药溶液1 mL/d灌胃，每mL含益肾解毒汤或氯沙坦的剂量相当于60 kg体重成人每日临床用量的10倍。每周为1个疗程，共灌胃2周。

1.4 标本采集 各组大鼠于造模后第14 d处死，留取左肾组织，10%甲醛固定。

1.5 指标检测 取各组大鼠肾组织石蜡包埋，以3 μm的厚度切片，烤片2 h。常规脱蜡，滴加一抗，4 ℃孵育过夜。滴加辣根过氧化物酶（HRP）-二抗，于37 ℃下孵育1 h。二氨基联苯胺（DAB）显色，光镜下控制显色效果。经苏木精复染，清水冲洗，梯度脱水，中性树胶封片。每组取6张切片，每张切片在400倍光镜下随机采集5个不重叠视野。棕黄色为阳性面积，用Image-pro-plus 5.1图像分析系统进行图像分析，计算其阳性面积，取平均值。

1.6 统计学方法 应用SPSS18.0统计学软件。计量资料以（）表示，组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏肉眼外观改变 UUO术后，梗阻肾体积增大，肾脏包膜增厚，肾脏体积增大明显，颜色暗淡，实质变薄。非梗阻肾脏外观无改变，色深红。其中益肾解毒汤组及氯沙坦组梗阻侧肾脏肿大及积水程度相对较模型组轻，色泽稍红润，模型组梗阻侧肾脏肿大及积水程度最严重，颜色最暗淡，实质最薄。

2.2 24 h尿蛋白定量 模型组24 h尿蛋白定量与假手术组比较显著升高（P＜0.05）。益肾解毒汤组和氯沙坦钾组24 h尿蛋白定量均高于假手术组（P＜0.05），益肾解毒汤组和氯沙坦钾组24 h尿蛋白定量均低于模型组（P＜0.05）。与氯沙坦钾组相比，益肾解毒汤组24 h尿蛋白定量下降了9.6%（P＜0.05）。益肾解毒汤组与模型组比较，24 h尿蛋白定量下降了29.7%（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠24h尿蛋白定量比较 (，mg/24 h)

表1 各组大鼠24h尿蛋白定量比较 (，mg/24 h)

注：与假手术组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05

组别 n 24 h尿蛋白定量假手术组 12 6.62±0.97模型组 12 10.70±1.02a益肾解毒汤组 12 7.52±0.78a、b氯沙坦组 12 8.32±0.57a、b

2.3 免疫组织化学染色 免疫组化染色PCNA、ED1，iNOS的阳性物质均呈棕褐色。模型组的各指标的阳性表达面积要明显高于假手术组（P＜0.05）。益肾解毒汤组与模型组比较，PCNA、ED1，iNOS阳性表达面积均有减少（P＜0.05）;益肾解毒汤组与氯沙坦组相比，PCNA、ED1，iNOS阳性表达面积均减少（P＜0.05）。见表2，图1～3。

表2 各组大鼠肾组织PCNA、ED1、iNos免疫组化结果(,μ m2)

表2 各组大鼠肾组织PCNA、ED1、iNos免疫组化结果(,μ m2)

注：与假手术组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与益肾解毒汤组比较，cP ＜0.05

组别 n PCNA ED1 iNOS假手术组 12 34.30±5.84 31.57±6.87 36.54±5.77模型组 12 73.2±9.43a 65.25±12.05a 74.4±9.10a益肾解毒汤组 12 42.83±8.20a、b 40.72±8.09a、b 52.87±6.77a、b氯沙坦组 12 53.49±8.27a、b、c 51.76±7.85a、b、c 67.50±8.13a、b、c

3 讨论

肾间质纤维化是各种慢性肾损伤的共同转归，病理上主要表现为成纤维细胞增生、细胞外基质过度沉积,该过程的重要细胞基础是巨噬细胞与成纤维细胞,而巨噬细胞是致肾纤维化因子的主要来源之一。UUO是一种急性机械性肾损伤，10～14 d内引起肾间质成纤维细胞弥漫增殖，造成间质胶原沉积和纤维化形成[4]。它是目前广泛用于研究肾间质纤维化的动物模型[5]，具有造模周期短，模型稳定，成功率高等优点[6-7]。UUO造模后，从血液来源的巨噬细胞进入肾脏，巨噬细胞激活，分泌大量炎性因子和趋化因子，大量的炎性因子一方面通过旁分泌诱导肾小管上皮细胞凋亡[8]，另一方面通过旁分泌或细胞间的相互作用，刺激肌成纤维细胞的激活[9],成纤维细胞增殖,并大量分泌合成细胞外基质,上述过程恶性循环并级联放大[10]，最终导致肾脏结构损伤和功能改变。在单侧输尿管梗阻动物模型研究中发现巨噬细胞的浸润数量与成纤维细胞的数量呈正比。有研究显示，缺失活化型巨噬细胞的小鼠，其抗GBM肾炎肾脏损伤减轻[11]，反过来说明活化型巨噬细胞能加重肾损伤。Aitman 等[12]研究还发现，过度活化的巨噬细胞是引起肾小球肾炎的一个决定性因素。以上均说明，处于静息和非活化状态的巨噬细胞并无损伤作用，所以对巨噬细胞增殖及活化的研究得到了目前医学界的重视。

图1 各组大鼠肾组织PCNA染色（200×）

图2 各组大鼠肾组织ED1染色（200×）

图3 各组大鼠肾组织iNOS染色（200×）

目前认为，巨噬细胞增殖与活化导致肾纤维化的机制主要有如下几方面：（1）激活的巨噬细胞，分泌大量炎性因子和趋化因子，大量的炎性因子通过旁分泌诱导肾小管上皮细胞凋亡。（2）巨噬细胞可促进系膜细胞合成细胞外基质。（3）巨噬细胞分泌的大量炎性因子通过旁分泌或细胞间的相互作用，刺激肌成纤维细胞的激活[13]，成纤维细胞增殖,并大量分泌合成细胞外基质。(4)促进系膜细胞表达细胞外基质降解酶抑制物-金属蛋白酶组织抑制剂-1,导致细胞外基质积聚[14]。（5)活化巨噬细胞本身产生大量TGF-β与IL-1等致纤维化细胞因子。上述巨噬细胞的作用最终导致肾脏结构损伤和功能改变。

肾纤维化是慢性肾衰竭过程中的主要病理变化，从中医角度，肾纤维化可以认为是在肾内形成的微型徵积。本研究所用的中药制剂益肾解毒汤由生黄芪、生大黄、生地黄、丹参、六月雪、茯苓、黄柏、山萸肉、鹿衔草、淮山药等组成，以健脾补肾、益气滋阴、活血化瘀、通腑泄浊、解毒利水为组方原则，起到了扶正祛邪的作用。从现代药理来看，黄芪作为中医治疗“肾病”方剂中的常用药,亦作为本方的君药，其疗效已为长期临床观察证实，如在糖尿病肾病治疗中使用黄芪可以起到很好的效果，降低尿蛋白，改善肾脏功能[15]。王海燕等在研究黄芪当归合剂肾保护作用的机制中发现，黄芪可减少单核/巨噬细胞浸润及减轻肾间质纤维化损伤[16]。而方中另一要药大黄也对巨噬细胞有不可小觑的作用。何东元等[17]通过研究发现，大黄酸能够同时下调TGF-β1的表达，有效抑制巨噬细胞增殖，起到抗纤维化的作用。我们知道，血瘀始终贯穿于整个肾纤维化的过程，故活血化瘀在这个过程中极其重要，丹参作为活血化瘀药物的代表，对抗肾纤维化也作用明显，如陈奇等[18]的研究表明丹参注射液可减少巨噬细胞CD68浸润程度，改善5/6肾切除模型大鼠肾组织病理变化、减轻炎性损伤,从而起到抗纤维化的作用。

肾间质巨噬细胞积聚可促进肾间质纤维化的发生和进展，与肾损害进展密切相关,影响肾功能的预后。我们的研究发现，与假手术组相比，模型组肾组织中的PCNA、ED1，iNOS表达均明显增加（P＜0.05），三者的变化一致。与模型组相比，益肾解毒汤组能明显抑制PCNA、ED1，iNOS的表达，阳性染色面积显著减少（P＜0.05）。提示益肾解毒汤能抑制巨噬细胞的浸润、增殖及活化，发挥抗纤维化作用，从而产生对肾脏的保护作用。这可能是益肾解毒汤延缓肾小管间质纤维化，阻止肾功能进行性损害的部分机制之一。