用于治疗非小细胞肺癌的阿法替尼脂质体的制备与包封率的测定

吕晓燕 尹君婧 杨秀成 刘沙 孙考祥

据2015年中国癌症统计显示，非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer,NSCLC）约占肺癌的85%，75%的患者发现时已处于中晚期，转移后5年生存率低至17.1%[1]。传统治疗方案一般使用铂类药物进行化疗，但治疗的有效率仅为10%左右。2004年，研究发现，NSCLC与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）突变有关，自此肺癌的治疗进入分子靶向研究阶段。吉非替尼是第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI），对EGFR突变的患者疗效优于化疗[2]。但是患者在用药一年后出现TKI耐药，研究[3]表明这种TKI耐药主要是由于EGFR外显子的苏氨酸-790突变为蛋氨酸（T790M）。第二代不可逆EGFR酪氨酸激酶抑制剂-阿法替尼（afatinib）即是针对TKI继发性耐药开发研制的，它携带一个反应性的丙烯酰胺基，是ATP竞争苯胺基衍生物，能够阻止EGFR、HER2和HER4激酶，形成共价键和不可逆价键。临床研究表明阿法替尼与西妥昔单抗联用对继发性TKI耐药产生明显疗效[3-5]。但目前市售阿法替尼为片剂，口服给药生物利用度较低，且不良反应较多，其中胃肠道的不良反应和给药部位异常较为常见，严重者需中断给药或减少剂量进行控制[6-10]。为提高患者的生命质量，更好的发挥药效，开发一种具有靶向性、生物利用度高、不良反应少的阿法替尼新型制剂势在必行。

本研究采用脂质体作为药物载体，并在表面链接甲氧基聚乙二醇磷脂（DSPE-PEG2000），实现药物在体内的长循环作用，提高生物利用度，减少药物对胃肠道的刺激，降低不良反应的发生。脂质体的制备方法包括薄膜分散法、逆向蒸发法、有机溶剂注入法、梯度载药法等，其中薄膜分散法、逆向蒸发法和有机溶剂注入法为被动载药，包封率相对较低；而梯度载药法为主动载药，包封率高。本研究先后采用薄膜分散法、逆向蒸发法、改良的乙醇注入法和硫酸铵梯度法制备脂质体，通过葡聚糖凝胶微柱离心纯化脂质体，采用紫外分光光度法测定脂质体的包封率，用Nicomp 380 ZLS激光粒度仪测定脂质体的粒径，进一步优化处方工艺参数，以确定阿法替尼脂质体的最佳制备方法。

1 材料与方法

1.1 材料 IKA旋转蒸发仪（德国IKA公司），DF-101Z集热式恒温磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司），电子分析天平（美国Mettler Toledo公司），JY92-II超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司），Nicomp 380 ZLS激光粒度仪（美国PSS公司），离心机Primo R（美国SORVALL公司），UV-2450紫外分光光度仪（日本SHIMADZU公司）。阿法替尼双马来酸盐（afatinib dimaleate）（武汉瑞立升科技发展有限公司，批号：20160615），高纯氢化大豆磷脂（HSPC）（上海艾韦特医药科技有限公司，批号：B50337），胆固醇（CH）（上海缘聚生物科技有限公司），甲氧基聚乙二醇磷脂（DSPE-PEG2000）（烟台芃硕生物科技有限公司，批号：C01126），硫酸铵（天津市致远化学试剂有限公司），氯化钠（天津市恒兴化学试剂制造有限公司），葡聚糖凝胶G-50（华中海威基因科技有限公司），无水乙醇（天津市永大化学试剂有限公司），甲醇（天津市富宇精细化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 制备工艺的选择

1.2.1.1 薄膜分散法 取膜材HSPC、CH、DSPE-PEG2000按质量比4:1:1溶于适量的无水乙醇，旋转蒸发仪减压旋转形成薄膜，加入适量阿法替尼溶液，65 ℃水化20 min，制得脂质体初品。经超声细胞粉碎机200 W 2 min、400 W 6 min后，依次通过0.80 μm、0.45 μm、0.22 μm的微孔滤膜，即得阿法替尼脂质体。

1.2.1.2 逆向蒸发法 取膜材HSPC、CH、DSPE-PEG2000按质量比4:1:1溶于适量的无水乙醇，加入阿法替尼溶液，进行短时超声，直至形成稳定的W/O型乳剂。减压除去乙醇，经超声细胞粉碎机200 W 2 min、400 W 6 min后，依次通过0.80 μm、0.45 μm、0.22 μm的微孔滤膜，即得阿法替尼脂质体。

1.2.1.3 改良的乙醇注入法 取膜材HSPC、CH、DSPEPEG2000按质量比4:1:1溶于适量的无水乙醇，加入预热至相同温度的阿法替尼溶液，65 ℃水浴搅拌20 min，经超声细胞粉碎机200 W 2 min、400 W 6 min后，依次通过0.80 μm、0.45 μm、0.22 μm的微孔滤膜，即得阿法替尼脂质体。

1.2.1.4 硫酸铵梯度法 取膜材HSPC、CH、DSPE-PEG2000按质量比4:1:1溶于适量的无水乙醇，加入预热至相同温度的200 mmol/L的硫酸铵溶液，65 ℃水浴搅拌20 min，得空白脂质体初品。经超声细胞粉碎机200 W 2 min、400 W 6 min后，依次通过0.80 μm、0.45 μm、0.22 μm的微孔滤膜，得空白脂质体混悬液。将制得的空白脂质体，常温下透析除去脂质体外水相的硫酸铵。以药脂质量比1:8向脂质体混悬液中加入一定体积阿法替尼溶液，60 ℃孵育10 min，即得阿法替尼脂质体。

1.2.2 阿法替尼含量的测定方法

1.2.2.1 最大吸收波长的选择 配制一定浓度的阿法替尼甲醇溶液，取相应量不含阿法替尼的空白脂质体溶于甲醇中，以甲醇作为空白对照溶液，在200 nm-400 nm范围内扫描，确定最大吸收波长。

1.2.2.2 标准溶液的制备 配制浓度为5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL的阿法替尼甲醇溶液，使用紫外分光光度仪，设定吸收波长343.6 nm，测定吸光度，以吸光度A对浓度C（μg/mL）绘制标准曲线。

1.2.2.3 精密度的考察 配制低、中、高（5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL）3种浓度的阿法替尼甲醇溶液，同一天内连续测5次测定吸光度值，计算精密度。

1.2.2.4 重现性的考察 配制10 μg/mL的阿法替尼的甲醇溶液，连续测5次测定吸光度值，计算重现性。

1.2.2.5 方法回收率的考察 配制低、中、高（5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL）三个浓度的阿法替尼甲醇溶液，测定吸光度值，并通过标准曲线计算浓度，此浓度与理论浓度相比计算得方法回收率。

1.2.3 脂质体的纯化方法

1.2.3.1 葡聚糖凝胶G-50的预处理 取适量的葡聚糖凝胶G-50置于烧杯中，近沸水浴中加热5 h左右，使凝胶充分溶胀。放凉后用超纯水冲洗3遍，待用。

1.2.3.2 洗脱次数的选择 取脂质体200 μL滴加到葡聚糖微柱的中心，停留2 min后，500 rpm离心5 min，用甲醇定容至5 mL。之后加超纯水500 μL，1,500 rpm离心5 min，分次进行洗脱，每份洗脱液用甲醇定容至5 mL，于343.6 nm处测定每份洗脱液的吸光度。同法测定阿法替尼溶液的洗脱情况。

1.2.3.3 空白脂质体回收率的考察 取两份空白脂质体200 μL，一份直接用甲醇定容至10 mL，测吸光度为A0。一份上样于葡聚糖凝胶微柱，停留2 min后，500 rpm离心5 min。加超纯水500 μL，1,500 rpm离心5 min，重复洗脱2次。合并洗脱液，用甲醇定容至10 mL，测吸光度为A1。通过标准曲线计算C0、C1，回收率公式为R=（C1/ C0）×100%。

1.2.4 不同制备工艺脂质体包封率和粒径的测定 对不同工艺制备的脂质体包封率进行测定，用Nicomp 380 ZLS激光粒度仪对脂质体的粒径进行测定，在透射电镜下观察其形态，并对最佳制备工艺所制得的脂质体的载药量进行计算。

载药量（loading efficiency）是指单位重量或单位体积脂质体所负载的药量，LE（%）=We/Wm×100%，式中LE表示脂质体中药物的载药量百分数；We表示包封于脂质体内的药量；Wm表示载药脂质体的总重量。

1.2.5 单因素考察 通过对制备工艺的分析，本研究对HSPC与CH的质量比、afatinib与HSPC的质量比、硫酸铵的浓度、孵育温度与孵育时间等因素进行考察。在其他参数保持不变的条件下，只改变单一因素，以粒径和包封率为指标，考察该因素对脂质体制备工艺的影响。

1.2.5.1 HSPC与CH的质量比对脂质体的影响 在不改变其他因素的条件下，分别考察了HSPC与CH的质量比为2:1、4:1和6:1时对脂质体的包封率和粒径的影响。

1.2.5.2 Afatinib与HSPC的质量比对脂质体的影响 在不改变其他因素的条件下，分别考察了afatinib与HSPC的质量比为1:4、1:8和1:16时对脂质体的包封率和粒径的影响。

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1.2.5.3 硫酸铵的浓度对脂质体的影响 在不改变其他因素的条件下，分别考察了硫酸铵的浓度为150 mmol/L、200 mmol/L和250 mmol/L时对脂质体的包封率和粒径的影响。

1.2.5.4 孵育温度对脂质体的影响 在不改变其他因素的条件下，分别考察了孵育温度为50 ℃、60 ℃和70 ℃时对脂质体的包封率和粒径的影响。

1.2.5.5 孵育时间对脂质体的影响 在不改变其他因素的条件下，分别考察了孵育时间为5 min、10 min和15 min时对脂质体的包封率和粒径的影响。

2 结果

2.1 制备工艺的选择 采用薄膜分散法制得的脂质体，外观较混浊，不易过膜；采用逆向蒸发法制得的脂质体，外观半透明，略带蓝色乳光，较易过膜；采用改良的乙醇注入法制得的脂质体，外观半透明，略带蓝色乳光，较易过膜；采用硫酸铵梯度法制得脂质体，外观半透明，略带蓝色乳光，易过膜。

2.2 阿法替尼含量的测定方法

2.2.1 最大吸收波长的选择 阿法替尼溶液在1、2、3处均有吸收（图1），但因在第2处波长下脂质体膜材的干扰较大，第3处已接近近紫外端，故选择第1处——343.6 nm为最大吸收波长。

2.2.2 标准溶液的制备 计算吸光度A对浓度C的回归方程为y=0.027,2x+0.003,6，R2=0.999,4（图2），结果表明，在浓度范围为5 μg/mL-25 μg/mL时，标准曲线的线性良好。

2.2.3 精密度的考察 经测定，阿法替尼溶液低、中、高三种浓度的RSD值均小于1%（表1），结果表明方法的精密度良好。

2.2.4 重现性的考察 连续测定5次，阿法替尼溶液（10 μg/mL）的RSD值均小于1%（表2），结果表明方法的重现性良好。

2.2.5 方法回收率的考察 经测定，方法的回收率在99.74%-101.68%之间（表3），结果表明方法的回收率良好。

2.3 脂质体的纯化方法

2.3.1 洗脱次数的选择 实验结果表明，用超纯水洗脱两次时脂质体已洗脱99.17%（表4），而此时阿法替尼溶液不被洗脱，因此选择洗脱两次纯化脂质体。

2.3.2 空白脂质体回收率的考察 经计算，空白脂质体的回收率R为99.3%，表明葡聚糖凝胶微柱在此洗脱条件下对空白脂质体几乎没有吸附。

表1 阿法替尼溶液精密度测定结果（n=5）Tab 1 The precision results of afatinib solution (n=5)

表2 阿法替尼溶液重现性测定结果（n=5）Tab 2 The reproducibility results of afatinib solution (n=5)

图1 紫外最大吸收波长扫描图。A：阿法替尼；B：空白脂质体。Fig 1 The maximum absorption wavelength scanning of ultraviolet light.A:Afatinib; B:Blank liposomes.

图2 阿法替尼溶液标准曲线Fig 2 Standard curve of afatinib solution

2.4 包封率方法的确立 取脂质体200 μL滴加到葡聚糖微柱中心，停留2 min后，500 rpm离心5 min。随后加超纯水500 μL，1,500 rpm离心5 min，重复洗脱2次。合并洗脱液，用甲醇定容至10 mL，测吸光度为A1。取脂质体200 μL，直接用甲醇定容至10 mL，测吸光度为A0。通过标准曲线计算C1、C0，包封率根据公式EE=（C1/C0）×100%计算。

2.5 不同制备工艺脂质体包封率和粒径的测定 采用建立的包封率测定方法对四种不同制备工艺的脂质体进行测定，结果表明硫酸铵梯度法的包封率最高，为90.73%（表5），平均粒径为108.6 nm（图3）。经透射电镜观测，脂质体呈球形，形态规则完整，可观察到双层膜结构，粒径分布均匀（图4），因此选择硫酸铵梯度法来制备阿法替尼脂质体。计算用硫酸铵梯度法制备的脂质体的平均载药量为7.52%。

图3 硫酸铵梯度法制备脂质体粒径分布（粒径：108.6 nm，P.I.：0.154）Fig 3 Particle size distribution of liposomes prepared by ammonium sulfate gradient method (particle size:108.6 nm,P.I.:0.154)

图4 硫酸铵梯度法制备脂质体透射电镜照片。A：0.5 μm；B：0.2 μm。Fig 4 Transmission electron micrograph of liposomes prepared using ammonium sulfate gradient method.A:0.5 μm; B:0.2 μm.

表3 阿法替尼溶液方法回收率结果（n=5）Tab 3 Theresults of recovery experiments of afatinib solution (n=5)

表4 不同洗次数对脂质体和阿法替尼溶液洗脱结果影响（n=3）Tab 4 Effect of different elution times on the results of liposomes and afatinib solution (n=3)

2.6 单因素考察 当HSPC与CH的比例为4:1（表6），afatinib与HSPC的比例为1:8（表7），硫酸铵的浓度为250 mmol/L（表8），孵育温度为60 ℃（表9），孵育时间为10 min（表10）时，脂质体的包封率高，粒径小。因此，最终确定脂质体的制备工艺为：取膜材HSPC、CH、DSPE-PEG2000按质量比4:1:1溶于适量的无水乙醇中，于65 ℃水浴中加热溶解，加入预热至相同温度的250 mmol/L的硫酸铵溶液，65 ℃水浴搅拌20 min，得空白脂质体初品。经超声细胞粉碎机200 W 2 min、400 W 6 min后，依次通过0.80 μm、0.45 μm、0.22 μm的微孔滤膜，得空白脂质体混悬液。将制得的空白脂质体常温下透析，除去脂质体外水相的硫酸铵。以药脂比1:8向此梯度脂质体混悬液中加入一定体积的阿法替尼溶液，60 ℃孵育10 min。即得阿法替尼脂质体。

3 讨论

脂质体的制备方法包括薄膜分散法、逆向蒸发法、有机溶剂注入法、梯度载药法等，其中薄膜分散法多用于脂溶性药物的包载，其成膜的均匀性较为关键，所制得的脂质体粒径较大；逆向蒸发法适于包封水溶性的药物，制得的脂质体内水相较大且包封率较高；有机溶剂注入法操作简单，尤其是乙醇注入法可以避免高毒性的有机溶剂残留问题，在近年的放大生产研究中较为常用；而梯度载药法为主动载药的制备方法，适用于水溶性药物的包载，制得的脂质体包封率高。本研究先后采用薄膜分散法、逆向蒸发法、改良的乙醇注入法和硫酸铵梯度法来制备脂质体，通过对比4种制备方法的包封率和粒径，最终确定制备阿法替尼脂质体的最优工艺为硫酸铵梯度法。硫酸铵梯度法属于梯度载药法的一种，其方法是先制备空白脂质体，在空白脂质体内外形成离子梯度，水溶性的阿法替尼双马来酸盐在离子梯度的作用下进入空白脂质体，并在脂质体内与硫酸铵形成溶解度较小的盐，使药物滞留在脂质体内，此方法制得的脂质体包封率高，粒径小。

常用的脂质体纯化的方法有柱过滤法、超滤法、离心法等。本研究先后考察葡聚糖凝胶过滤法、超滤法、阳离子交换树脂法和葡聚糖微柱离心法。葡聚糖凝胶过滤法虽然可以达到分离的效果，但是操作繁琐，耗时较长，不易操作；超滤法所用的超滤管的膜材对阿法替尼有吸附作用，不能有效地纯化脂质体，导致包封率测定不准确；阳离子交换树脂法，操作简单，因阿法替尼的理化性质，游离药物可完全吸附于微柱上，但是阳离子交换树脂为黄色，虽预处理时已洗净至肉眼观察为无色，但其对测定仍有干扰，所测包封率偏高；而葡聚糖微柱离心法，操作简单，能有效地纯化脂质体，经验证后选定为脂质体纯化的方法。

表5 不同工艺对脂质体包封率和粒径影响（n=3）Tab 5 Effect of different process on encapsulation efficiency and particle size (n=3)

表6 HSPC与CH比例对脂质体包封率和粒径的影响（n=3）Tab 6 Effect of the ratio of HSPC and CH on liposome encapsulation efficiency and particle size (n=3)

表7 Afatinib与HSPC比例对脂质体包封率和粒径的影响（n=3）Tab 7 Effect of the ratio of afatinib to HSPC on liposome encapsulation efficiency and particle size (n=3)

表8 硫酸铵浓度对脂质体包封率和粒径的影响（n=3）Tab 8 Effect of ammonium sulfate concentration on liposomes encapsulation efficiency and particle size (n=3)

表9 孵育温度对脂质体包封率和粒径的影响（n=3）Tab 9 Effect of incubation temperature on liposome encapsulation efficiency and particle size (n=3)

表10 孵育时间对脂质体包封率和粒径的影响（n=3）Tab 10 Effect of incubation time on liposome encapsulation efficiency and particle size (n=3)

常用的测定药物含量的方法有：紫外分光光度法和高效液相色谱法等。高效液相色谱法测定准确，但是操作繁琐，进样前需再次过滤样品，并需充分平衡色谱柱；紫外分光光度法操作简便，测样时间短，经验证可满足样品测定所需条件，故选用紫外分光光度法作为测定包封率的方法。

本研究采用硫酸铵梯度法成功制备阿法替尼脂质体，并通过葡聚糖微柱离心纯化脂质体，利用紫外分光光度法测定包封率，操作简单，可重复性好。本研究为阿法替尼的给药方式提供了新的思路，在减轻患者的不良反应方面做出了努力，为阿法替尼的广泛应用打下了基础。