中国荷斯坦牛TLR2基因SNPs的快速筛查及等位基因频率的估算

杨永江，吴恩芸，任稳稳，马博妍，高成宏，李宏旭，刘丽霞，曹 忻，臧荣鑫，杨具田，张 丽

(西北民族大学 生命科学与工程学院， 甘肃 兰州 730030)

Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)是一类在生物进化过程中较保守的模式识别受体，能对感染机体的病原微生物直接做出免疫防御，在天然免疫防御中发挥重要作用[1]。TLRs能够直接识别不同微生物表面的病原相关分子模式，激活先天免疫应答[2]。作为TLRs家族成员，TLR2通过识别多种病原微生物及其产物，介导天然免疫，并且通过细胞内信号转导，启动获得性免疫，其在巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和T淋巴细胞等多种免疫细胞表面均有表达[3]。研究证实，TLR2受体能够识别大多数病原微生物及其产物，能够识别革兰阳性菌的肽聚糖和脂磷壁酸，革兰阴性菌的类脂A、分支杆菌和脂蛋白与脂肽和细菌DNA等[4]，但TLR2不直接识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，而是和TLR6形成异源二聚体来提高TLR6对PAMPs的识别能力[5]。有研究显示，荷斯坦牛TLR2基因含有丰富的多态性，并与乳腺炎抗性显著相关[6]。

牛TLR2基因位于17号染色体[7]，基因全长13 226 bp，mRNA序列全长3 513 bp，编码784个氨基酸，共有2个外显子，其中第2外显子为TLR2蛋白的编码区。牛TLR2基因多集中于该基因与奶牛乳腺炎的相关性研究。研究发现，TLR2基因通过识别金黄色葡萄球菌和链球菌，激活NF-kB通路，释放炎性因子，从而导致乳房炎的发生。患病牛乳腺区域TLR2 mRNA的表达量显著高于正常牛乳腺区域mRNA的表达，TLR2基因表达量可增至4～13倍[8-9]。另外，乳房炎作为奶牛常见病之一，严重影响了我国乳业的发展。TLR2基因单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms，SNPs)可作为荷斯坦牛乳房炎抗性的候选功能性SNP位点[10-12]。本研究利用DNA池测序对中国荷斯坦牛TLR2基因SNP进行快速筛查，旨在寻找奶牛TLR2基因的新型分子标记，以开发奶牛抗乳房炎的候选功能性SNP。

1 材料与方法

1.1 血样采集及DNA池的构建

血样采自宁夏农垦贺兰山奶业有限公司的350头荷斯坦牛，采集尾静脉血10 mL。以苯酚-氯仿法抽提基因组DNA[13]，1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，紫外分光光度计测量每个DNA样品浓度3次，取平均值，加双蒸水调整DNA样品浓度至100 ng·μL-1，各DNA样品吸取2 μL构建DNA池。

1.2 引物设计和PCR扩增

使用Primer6.0软件在牛TLR2基因(NM_174197)上设计4对特异性引物(表1)，交由苏州金唯智生物有限公司合成。PCR扩增体系为40 μL，含DNA池模板2.0 μL，0.25 μmol·L-1上下游引物各0.8 μL，2×TaqPCR Master Mix 22.0 μL，蒸馏水14.8 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、退火30 s、72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，2%琼脂糖凝胶对扩增产物进行检测。

1.3 等位基因频率估算

1.4 生物信息学分析

对中国荷斯坦牛TLR2基因编码区生物信息学分析按照参考文献[15]的在线软件进行。

表1 牛TLR2基因SNP检测用引物列表Table 1 The information of primers

2 结果与分析

2.1 荷斯坦牛TLR2基因DNA池PCR扩增结果

DNA池P1、P2、P3、P4引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示(图1)，扩增产物条带清晰明亮，条带单一，扩增产物大小与预期目的片段长度相符。

M，DNA marker 600 bp；1，P1引物扩增结果；2，P2引物扩增结果；3，P3引物扩增结果；4，P4引物扩增结果。M, DNA marker 600 bp; 1, P1 primer amplification results; 2, P2 primer amplification results; 3, P3 primer amplification results; 4, P4 primer amplification results.

2.2 DNA池扩增产物序列测定

中国荷斯坦牛DNA池P1、P2、P3和P4引物PCR扩增产物测序结果与牛TLR2基因标准序列(NM_174197)进行比对后共发现6个SNPs(图2)，其中P1引物检测到TLR2基因第2内含子602 bp处发生T→A的突变(命名为T602A)； P3引物检测到TLR2基因第2外显子10 634 bp处发生T→G的突变(T10634G)，10 900 bp处发生G→C的突变(G10900C)，T10634G为错义突变(Gly63Asp)；P4引物检测到中国荷斯坦牛TLR2基因第2外显子11 047、11 096、12 077 bp处发生G→C、G→C、A→T和C→T的突变，分别命名为G11047C、A11076T、C12077T，均属于同义突变。其中T602A、T10634G、G10900C为牛TLR2基因首次发现的SNP位点。

2.3 SNPs筛查及等位基因频率估算

利用MWSnap软件标尺测量中国荷斯坦牛测序峰图中各SNPs等位基因峰图高度，并估算各突变位点的等位基因频率(表2)。由表2可知，等位基因频率在突变前后有明显差异。

图2 TLR2基因6个SNP测序结果Fig.2 Sequencing results of six SNP of TLR2 gene in Holstein cattle

表2 牛TLR2基因6个SNP等位基因频率估算Table 2 Estimation of 6 SNP alleles in the cattle TLR2 gene

2.4 中国荷斯坦牛TLR2基因SNPs对mRNA二级结构的影响

外显子2处的突变位点T10634G进行mRNA二级结构预测分析表明，SNPs突变前后引起mRNA二级结构改变，并导致mRNA二级结构的最小自由能发生改变，如图3所示。T10634G位点突变前后的自由能由-677.00 kcal·mol-1变为-683.60 kcal·mol-1，影响mRNA二级结构稳定性，可能影响随后蛋白质的翻译过程。

2.5 突变前后荷斯坦牛TLR2蛋白质二级结构和三级结构预测分析

使用在线软件http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html分析荷斯坦牛TLR2基因SNPs对蛋白二级结构的影响结果如图4所示。其中T10634G野生型α-螺旋(Hh)、β-折叠(Ee)、β-转角(Tt)和无规则卷曲(Cc)比例分别为46.30%、17.86%、7.02%和28.83%，突变型则为45.79%、18.49%、7.02%和28.70%。

通过ESypred3D Web Server 1.0同源建模对TLR2蛋白进行三维结构预测，得到预测的TLR2膜外区的立体三维结构(图5)。预测结果表明，TLR2膜外区蛋白由背面多个α-螺旋和内面多个β-折叠构成，α-螺旋和β-折叠平行交替排列，构成一个弯曲状螺旋结构；突变前后TLR2蛋白三级结构无明显改变。

h, α螺旋； e, β折叠； t, β-转角; c, 无规则卷曲。h， Alpha helix; e， Extended strand; t， Beta turn; c， Random coil.

图中黑色代表α螺旋(Alpha helix)，深灰色代表β折叠(Extended strand)，浅灰色代表β-转角和无规则卷曲(Beta turn and Random coil)。Black represents alpha helix; Dark grey represents beta folding; Light grey represents Beta turn and random coil.图5 荷斯坦牛TLR2 蛋白三级结构模型预测Fig.5 Putative result of TLR2 protein tertiary structure in Holstein cattle

3 讨论

3.1 中国荷斯坦牛TLR2基因SNPs快速筛查及等位基因频率分析

Toll样受体(TLRs)是一类病原模式识别受体基因，是连接特异性免疫和非特异性免疫的桥梁。鸡体内已发现10种TLRs，可识别广泛的病原微生物及其代谢物，与禽类的抗病力显著相关[16]。哺乳动物及人类中已经发现的TLRs家族成员有11个，其中TLR2可以促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应。在一定的条件下，脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)可激活TLR2信号途径，产生促凋亡蛋白(Fas-associated death domain protein，FADD)和Caspase-8，导致表达TLR2的细胞发生凋亡，从而可降低过度的免疫应答，调控机体对入侵病原体的免疫应答在适度的水平[17]。

SNP是染色体基因组中单个核苷酸碱基以颠换、转换、插入和缺失等形式突变所引起的DNA序列的多态性，哺乳动物基因组平均每300～1 000 bp就有1个SNP，SNP不仅是基因组水平上最常见的遗传变异类型，还具有多态性丰富和遗传稳定性高等优点。

目前对牛TLR2基因的SNP研究多集中于该基因外显子2区域，刘利等[12]在荷斯坦牛TLR2基因的外显子2区域发现5个SNP位点，其中G11047C、A11076T也在本次多态性筛查中出现；白杰等[19]在荷斯坦牛TLR2基因的外显子2区域上发现T10634G突变，为错义突变，氨基酸由天冬氨酸(Asp)突变为谷氨酸(Gly)。

另外，不同群体的牛TLR2 SNP研究也呈现不同的研究结果，Pant等[20]在加拿大荷斯坦公牛群体中没有检测到TLR2基因的多态位点；白杰等[19]在新疆褐牛和中国荷斯坦奶牛群体中发现3个SNPs，其中A12705T位点为本研究未发现位点，而A11076G位点发生的三等位基因错义突变在本研究中为A11076T为双等位基因位点，且为同义突变。本研究发现的结果与白杰等[19]的研究结果存在较大差异。本研究显示，DNA池测序法可用于SNP的高效筛查[18]，利用DNA池测序法，我们在荷斯坦牛TLR2基因内发现了6个SNPs，分别为T602A、G10900C、G11047C、A11076T、C12077T和T10634G，其中T602A、T10634G、G10900C为牛TLR2基因首次发现的SNP位点，T10634G为错义突变，氨基酸由原来的谷氨酸(Gly)转变为天冬氨酸(Asp)，这与白杰等[19]的研究结果不同，造成差异过大可能是所选择的奶牛群体不同所造成的，宁夏和新疆、加拿大地区的环境、管理和选育模式的差异在一定程度上也会影响奶牛的遗传背景。

同义突变对基因功能的影响要比错义突变影响小，同义突变虽然不影响编码的氨基酸序列，但同义突变可能引起外显子的拼接增强，从而影响蛋白质的表达量，在一定程度上会改变蛋白质的空间结构，进而影响该蛋白质的正常功能[21]。错义突变能显著引起氨基酸的改变，通过影响编码的氨基酸序列来影响蛋白质的功能。

3.2 中国荷斯坦牛TLR2蛋白质及SNPs生物信息学分析

基因外显子的核苷酸突变可能引起 mRNA二级结构的改变，从而引起蛋白质结构的改变，进而影响其生物学功能。荷斯坦牛TLR2基因mRNA二级结构预测结果表明，SNP位点可影响基因mRNA二级结构和自由能，影响mRNA结构的稳定性，如T10634G突变前后的自由能降低了6.60 kcal·mol-1，T10634GT→G的变异可增加mRNA结构的稳定性，而这种改变可能引起TLR2基因表达效率的改变，相关结论仍需要实验的进一步证实。

蛋白质二级结构指在它的多肽链中有一些规则重复的构象，主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角，有效地对其进行预测和分析有助于研究该蛋白质功能。TLR2蛋白质二级结构中，α-螺旋占主导地位，荷斯坦牛TLR2预测结果显示二级结构中Hh>30%，Ee>15%，由此可推测荷斯坦牛TLR2蛋白为混合型二级结构[27]。T10634G的突变可引起编码氨基酸的改变，使TLR2蛋白α-螺旋(Hh)由46.30%降低至45.79%，β-折叠(Ee)由17.86%增加至18.49%，无规则卷曲(Cc)由28.83%降低至28.70%。由于α螺旋和无规则卷曲是蛋白质肽链中构成配体受体结合的活性部位，无规则卷曲易受侧链相互影响而改变空间构象[28]，因此TLR2基因T10634G突变可能会对蛋白二级结构的稳定性造成影响，具体结论仍需进一步研究。

本研究利用DNA池测序对荷斯坦牛TLR2基因的SNP进行了高效筛查，在此基础上我们将进行各SNPs与奶牛乳房炎的关联分析，以期为荷斯坦牛的抗病育种提供理论基础。