诺沃霉素A预防番茄采后灰霉病效果及抑菌谱

黄大野，高 苇，贲海燕，方 伟，王开梅，曹春霞※，饶 犇，刘晓艳，万中义，张亚妮，姚经武，朱志刚

（1. 湖北省生物农药工程研究中心，武汉430064；2. 天津市农科院植物保护研究所，天津 300381；3. 黑龙江省农业科学院园艺分院，哈尔滨 150069）

0 引 言

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是番茄的主要毁灭性病害，能侵染果实、花、叶、茎和种子[1-2]。防治该病害主要依靠单一作用位点的化学杀菌剂，如多菌灵、异菌脲、嘧菌环胺和啶酰菌胺等。但是，化学杀菌剂的使用极易造成灰霉病产生抗药性，在中国和世界范围内，灰葡萄孢已经对多种杀菌剂产生了抗药性[3-8]。另外也会造成农药残留及环境污染并威胁人类健康[9-10]。所以生产上急需更为安全有效的杀菌剂和防治方法。

与化学杀菌剂相比，生物制剂具有很多优势，利用多种作用机理来抑制病害的发生，如竞争位点和营养、重寄生作用、诱导抗性和产生次生抑菌物质等[11-13]。链霉菌是一种被广泛利用的生防菌，可以产生多种类型的天然产物，作为防治作物病害活性化合物。许多链霉菌产生的天然产物如多氧霉素、春雷霉素和井岗霉素等已经得到广泛的应用[14-16]链霉菌产生的。

诺沃霉素A和B是由湖北省生物农药工程研究中心分离和鉴定的2种全新结构的32元环大环内酯类化合物分子量 1 228.66。其产生菌为植生链霉菌（Streptomyces phytohabitans），菌种代号为 HBERC-20821， 保存在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M2013379。链霉菌分离自四川瓦屋山采集的土样。前期研究了液体发酵制备诺沃霉素的方法和农业生产上大规模应用的简单浓缩工艺[17-19]。大鼠急性经口、经皮和吸入试验表明未造成明显病理改变，毒性为微毒级[20]。通过琼脂稀释法测定了诺沃霉素A和B对几种植物病原菌minimum inhibition concentration（最小抑制浓度），结果表明对禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和颖枯壳针孢（Septoria nodorum）等几种植物病原真菌具有良好抑制效果。诺沃霉素A和B只在侧链有一处细微区别，母核结构相同。前期初步测定杀菌活性，发现杀菌活性无明显差异，故只对A杀菌性能进行进一步研究[19]。本试验选取诺沃霉素A进行对番茄果实灰霉病的防治效果研究，以期为诺沃霉素今后在防治番茄采后灰霉病的应用和推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：灰葡萄孢（B. cinerea）为多菌灵敏感菌株，核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、多主棒孢（Corynespora cassiicola）、茄链格孢（Alternaria solani）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、茶褐斑拟盘多毛孢（Pestalotiopsis guepinii）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）和劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）均由湖北省生物农药工程研究中心分离和保存。

供试药物：诺沃霉素 A原药（有效成分质量分数95%），制备方法参考文献[17]。98%多菌灵原药（安徽广信农化股份有限公司）。番茄为市场购买大番茄，品种为红星二号。

1.2 诺沃霉素A对灰葡萄孢离体抑菌效果

将灰葡萄孢菌从保存斜面活化到potato dextrose ager（PDA）培养基20℃培养5 d备用。将诺沃霉素A原药加入母液体积 1%N，N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide）溶解，随即加入无菌水配制成浓度为100μg/mL母液备用。多菌灵母液的配制方法和浓度同诺沃霉素 A。采用菌丝生长速率法，使用梯度稀释将诺沃霉素 A 稀释至25、12.5、6.25、3.125 和1.562 5μg/mL。多菌灵稀释至10.0、5.0、2.5、1.0和0.5μg/mL。待培养基温度降为45 ℃时，用灭菌枪头吸取1 mL药液，随后加入9 mLPDA培养基混匀，即药液稀释10倍，每个梯度浓度3次重复，以加入含1%DMF无菌水作为对照。随后用4 mm直径打孔器打取PDA平板培养的灰葡萄孢，接入各处理PDA平板中央。20℃黑暗培养5 d，用十字交叉法测量每个培养皿内菌落直径，用DPS软件求出诺沃霉素A和多菌灵对灰葡萄孢菌丝生长的毒力回归方程、相关系数r和抑制中浓度EC50（50% effective concentration）。

分别挑取少许含1.25μg/mL诺沃霉素A平板和对照菌丝于载玻片，在40倍光学显微镜（OLYMPUS CX21,Tokyo，Japan）观察处理和对照菌丝形态。

1.3 诺沃霉素A防治番茄果实灰霉病研究

将灰葡萄孢菌在PDA平板25℃培养14 d，用无菌水刷取孢子悬浮液，将其混入 0.05%的吐温 80，随后用纱布过滤，使用血球计数板将孢子浓度调到 5×104个孢子/mL。从市场购买大小一致，外皮没有破损的番茄。

用带1 mL无菌枪头分子枪在番茄中部相对应的两侧打孔，将诺沃霉素 A 稀释至 50 和 100μg/mL，浸果10 min，对照药剂使用有效成分25和12.5μg/mL多菌灵浸果10 min，空白对照使用无菌水浸果10 min。取出风干后滴入10μL灰霉孢子悬浮液，25℃保湿培养6 d[21-26]，试验设3个重复，每个重复10个番茄果实。统计方法和防效计算同上。

1.4 诺沃霉素A抑菌谱测定

按照1.2制备100μg/mL诺沃霉素A，采用菌丝生长速率法观察10μg/mL含药PDA培养基条件下对7种常见植物病原菌抑制效果，以加入质量分数 1%DMF无菌水作为对照。防效计算方法同上。劳尔氏菌在nutrient ager（NA）平板活化，挑取单菌落转入 SPA培养基，于170 r/min转速、30℃培养 24 h 后，将菌液均稀释至108cfu/mL，将0.5 mL菌液与45℃ 9.5 mL NA固体培养基混合制成含菌平板。随后放入灭菌滤纸片，滴入10μL诺沃霉素A药液，对照药剂为平板浓度10μg/mL氨苄青霉素钠，3 d后观察抑菌圈。

1.5 数据分析

使用DPS进行毒力回归方程计算，SAS9.1.3进行差异显著性分析，在0.05水平下进行单因素差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 诺沃霉素A对灰葡萄孢离体抑菌效果

表1为诺沃霉素A与多灵菌抑菌活性对比，诺沃霉素A对灰葡萄孢具有良好的抑菌活性，离体条件下在2.5、1.25、0.625、0.312 5和0.156 25μg/mL 5个梯度浓度均有一定的抑菌效果，经计算EC50为0.631μg/mL，相关系数r为0.999 7，说明试验浓度梯度设置合理。生产上防治灰霉病常用杀菌剂多菌灵EC50为0.157μg/mL，诺沃霉素A杀菌活性略低于多菌灵。与对照菌丝相比，经1.25μg/mL诺沃霉素A处理5 d后灰葡萄孢菌丝发生明显的膨胀、扭曲和变形（图 1），菌丝微观形态的影响可能是抑制灰霉病生长的一个重要因素。

表1 诺沃霉素A对灰葡萄孢抑菌活性Table 1 Inhibition activity of novonestmycin A on Botrytis cinerea

图1 显微镜条件下诺沃霉素A对菌丝生长影响Fig.1 Optical micrographs of the inhibition of fungal growth by novonestmycin A

2.2 诺沃霉素A预防番茄果实灰霉病效果

表 2为诺沃霉素 A、多灵菌及对照组对番茄灰霉病预防效果对比，离体组织试验表明，诺沃霉素 A对番茄果实灰霉病具有良好的防治效果。诺沃霉素 A在 50和100μg/mL浸果处理对番茄果实灰霉病防效分别达到68.29%和100%。多菌灵在12.5和25μg/mL浸果处理对番茄果实灰霉病防效分别为69.51%和100%。在处理浓度下诺沃霉素A和多菌灵对番茄果实灰霉病预防效果相当（P<0.05）。试验过程中在50和100μg/mL浸果处理条件下均未发现诺沃霉素对番茄果实表观造成药害，试验浓度下对番茄果表观形态安全（见图2）。100μg/mL及更高浓度可以作为实际应用中诺沃霉素A的浸果浓度，更高浓度诺沃霉素A对番茄果实安全性及最佳浸果时间需要进一步研究。

表2 诺沃霉素A对番茄灰霉病预防效果Table 2 Prevention of novonestmycin A on tomato gray mold

图2 诺沃霉素A对番茄果实灰霉预防效果Fig.2 Prevention effect of novonestmycin A on tomato fruit gray mold

2.3 诺沃霉素A抑菌谱

抑菌谱试验结果见表3，试验表明，诺沃霉素 A在10μg/mL条件下对子囊菌核盘菌S.sclerotiorum抑菌率为86.11%、对半知菌多主棒孢C.cassiicola、茄链格孢A.solani、胶孢炭疽菌C.gloeosporioides、茶褐斑拟盘多毛孢P.guepinii和担子菌立枯丝核菌R.solani抑菌效果分别为91.11%、82.78%、77.22%、86.46%和85.56%，抑菌率均达到75%以上。对卵菌纲辣椒疫霉P.capsici无抑菌作用。在细菌抑菌试验中，抑菌圈法表明诺沃霉素A在10μg/mL处理条件下对劳尔氏菌R.solanacearum无抑菌圈，而对照杀细菌药剂氨苄青霉素钠在相同浓度下具有明显抑菌圈（图 3），即诺沃霉素 A对细菌劳尔氏菌R.solanacearum无抑菌效果。诺沃霉素A在防治半知菌引起的作物病害表现出一定的防治潜力，对由上述病原菌引起的病害的田间防效、应用技术及对应作物的安全性需要进一步评价。

表3 诺沃霉素A对植物病原菌离体抑菌效果Table 3 In vitro inhibition of plant pathogens with novonestmycin A

图3 诺沃霉素对劳尔氏菌抑菌活性Fig.3 Inhibition activity of novonestmycin A on Ralstonia solanacearum

3 讨 论

研究表明诺沃霉素A对番茄果实灰霉病具有良好的预防效果，对其作用机理和与其他灰霉病防治药剂的交互抗药性值得进一步研究，为灰霉病抗性菌株的治理和杀菌剂交替和混合使用奠定基础。

诺沃霉素A对常见植物病原真菌核盘菌、胶孢炭疽和立枯丝核菌等具有良好抑制效果，其离体抑菌活性均为首次报道。其对卵菌纲疫霉菌无效，不能用于其引起的作物疫病的防治。对细菌劳尔氏菌无效，不能用于其引起的作物细菌青枯病防治。本研究共研究 9种病原菌抑菌活性，还需对其抑菌谱进行更深入的研究。在试验浓度下，对番茄表皮未造成影响，高浓度下对番茄的安全性需要进一步研究。

最近的研究表明大环内酯类化合物抑菌机理为直接与真菌细胞膜麦角甾醇结合从而抑制真菌生长[27-29]。麦角甾醇是子囊菌、担子菌和半知菌等大多数真菌细胞膜重要组成部分，卵菌纲病害和细菌不含有麦角甾醇[30]。诺沃霉素A对卵菌纲辣椒疫霉菌P. capsici和细菌劳尔氏菌R.solanacearum无效，而对其他隶属于囊菌、半知菌和担子菌 6种真菌具有明显的抑菌效果。通过其化学结构类型和抑菌谱研究表明麦角甾醇可能为诺沃霉素A抑制真菌的作用靶标，药剂对真菌麦角甾醇合成影响需要进一步验证。

大环内脂类抗生素纳他霉素通过作用于麦角甾醇而对大多数真菌和酵母菌具有抑制和杀灭活性，其具有不易产生抗药性，无致癌、致畸形、致突变和过敏性等优点，被广泛应用于食品防腐和水果保鲜[31]。同为大环内酯诺沃霉素在食品防腐和其他水果保鲜，例如柑橘青霉病的应用值得进一步研究。

4 结 论

本研究通过离体抑菌、果实预防和抑菌谱试验，研究结果如下：

1）诺沃霉素A对灰葡萄孢具有良好的抑菌效果，离体抑制中浓度为0.631μg/mL。

2）经1.25μg/mL 诺沃霉素A处理的菌丝发生明显的肿胀和变形。经50和100μg/mL诺沃霉素A浸果处理对番茄果实灰霉病防效分别为68.29%和100%。对番茄安全无药害，在防治番茄果实灰霉病具有良好的应用前景。

3）诺沃霉素A对核盘菌、胶孢炭疽和立枯丝核菌等常见植物病原真菌具有抑菌效果，对卵菌纲辣椒疫霉P.capsici和细菌劳尔氏菌R.solanacearum无效。

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