固相萃取高效液相色谱荧光法测定炒制坚果中苯并(a)芘残留量

陶华平

(宁德市食品药品检验检测中心， 福建 宁德 352100)

当前，已经发现的致癌化学物质约有400种，其中200多种属于多环芳香烃类化合物。苯并芘(BaP)又称3，4-苯并芘，是多环芳烃类化合物的一种，由苯与芘糅合而成。苯并芘致癌性强，且对检测灵敏度高，故其被作为多环芳烃(Polycyclic aromatic hy-drocarbons，简称PAH)的指标化合物[1]。依据苯与芘不同的糅合位置，可将苯并芘分为苯并(a)芘和苯并(e)芘两种异构体。

坚果营养丰富，富含蛋白质、油脂、矿物质、维生素等。但在炒制过程中，如果温度过高，则会使这些有机物发生热裂解反应，再经环化、聚合，就生成了如苯并(a)芘等一些多环芳烃物质。另一方面，坚果在生长过程中其根系会从水、土中吸收有机污染物，且其果实也有可能从大气中吸附苯并(a)芘。

对苯并(a)芘研究大多集中在熏烤肉制品、油炸食品中，对炒制食品研究较少。目前，对坚果炒货卫生质量研究也更加关注黄曲霉B1等致癌物质的测定，很少开展多环芳烃污染的研究。食品安全国家标准GB 5009.27-2016《食品安全国家标准 食品中苯并(a)芘的测定》并未涉及坚果炒货的测定。本研究旨在结合坚果炒货特点，探讨测定坚果炒货中苯并(a)芘的方法。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

仪器：岛津高效液相色谱仪(LC-20A)；配荧光分光检测器(RF-20A);飞鸽牌高速离心机(TDL-5-A)；德国IKA旋涡振荡仪(MS3)；舒美超声波仪(KQ-500E)；SENCO旋转蒸发仪(W2-100SP)；北京优晟氮吹仪(UGC-24)。

1.2 试剂与材料

正己烷(色谱纯，SINENCE)、乙腈(色谱纯，J.T.BAKER)、甲苯(色谱纯，ourchem)、丙酮(色谱纯，fisher chemical)、超纯水、中性氧化铝柱(月旭科技，22 g,60 mL)、微孔滤膜(0.45 μm)、苯并(a)芘标准溶液(100 μg·mL-1，北京坛墨质检科技有限公司)。

1.3 样品前处理

称取经去壳、粉碎均匀的样品1 g(精确至0.001 g)于10 mL离心管中，加入5 mL正已烷与丙酮混合溶液正已烷∶丙酮(V∶V=3∶1)，旋涡混合30 s，于40℃下超声提取15 min,于5 000 r·min-1离心机中离心5 min，转移出上层清液。再加入5 mL混合溶液重复提取1次，合并上清液，待净化。

1.4 样品净化

中性氧化铝柱用30 mL正已烷活化，将上述净化液转移入中性氧化铝柱，收集流出液，并用50 mL正已烷洗脱，继续收集净化液。将净化液在40℃旋转蒸发至约5 mL,后转移至刻度试管，40℃氮吹近干，用1 mL甲苯复溶，过0.45 μm滤膜备用。

1.5 标准使用液配制

移取100 μg·mL-1苯并(a)芘标准溶液0.5 mL用甲苯定容至50 mL，配制成1 μg·mL-1标准中间液。将苯并(a)芘标准中间液(1.0 μg·mL-1)稀释10倍后浓度为100 ng·mL-1标准使用液。

1.6 色谱条件

色谱柱：InertSustain C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；激发波长：384 nm；发射波长：406 nm；柱温：35℃；流速：1.0 mL·min-1；流动相：乙腈：水=90∶10；进样体积：10 μL。

2 结果与分析

2.1 萃取溶剂的选择

已有的研究表明，苯并(a)芘可溶于非极性及中等极性有机溶剂中，结合几种常用的有机溶剂，本研究考察了正已烷、二氯甲烷、丙酮3种溶剂的提取效果。结果表明，二氯甲烷沸点较低，在常温下极易挥发，在试验过程中损耗较大，且对苯并(a)芘萃取效率不如正已烷。由图1可以看出丙酮虽萃取效率高，但其对BaP和其他杂质都具有较强萃取能力，容易引入杂质。提取出的杂质会干扰BaP的准确定量而选择单一正已烷，萃取效果并不理想。正已烷∶丙酮(V∶V=3∶1)很好克服提取效果不佳及杂质萃取较多的问题。故本试验选取萃取溶液为正已烷∶丙酮(V∶V=3∶1)混合溶剂。

图1 不同溶剂萃取回收率对比 注：1为正已烷；2为丙酮；3为正已烷∶丙酮(1∶1)；4为正已烷∶丙酮(2∶1)；5为正已烷∶丙酮(2∶1)。

2.2 净化柱的选择

由于坚果中油脂含量较高，故选用对油脂具有较好吸附效果的中性氧化铝BaP专用柱(填充量为22 g)。该净化柱基于层析柱的原理，将油脂中的非极性干扰物质与苯并芘分离，达到去除检测中的干扰基质的作用。中性氧化铝BaP专用柱具有电中性表面，更易保留一些极性杂质，中性及碱性物质则能保持游离状态，使得苯并(a)芘更易洗脱。

2.3 色谱条件的选择

为了获得苯并(a)芘测定的最佳色谱条件，分别从流动相组成、流速和柱温等几个方面进行考察。首先，分别比较乙腈∶水(90∶10)、乙腈∶水(80∶20)、甲醇∶水(90∶10)、甲醇∶水(90∶10)4种流动相，结果发现选用乙腈∶水(90∶10)时，苯并(a)芘的峰形尖锐，而且可以与样品中的杂质达到较好的基线分离。分别在0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL·min-1等5个流速下进行试验，发现当流速为1.0 mL·min-1时，苯并(a)芘峰形尖锐，出峰时间也合适；通过设置柱温25℃、30℃、35℃、40℃进行分析，柱温为35℃，苯并(a)芘色谱峰和出峰时间最佳。所得标准工作液色谱图如图2所示。

图2 浓度为1.0 ng·mL-1标准溶液色谱图

2.4 线性方程和检出限

准确移取100 ng·mL-1苯并(a)芘标准液，用乙腈定容，配制成浓度为0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 ng·mL-1的标准曲线。按照试验确定色谱条件进样。曲线线性范围0.5～10 ng·mL-1，线性回归方程y=119 649x+1 831.08，相关系数为0.999 8。以3倍信噪(S/N)比计算苯并(a)芘的检出限为0.15 μg·L-1，10倍信噪(S/N)比计算苯并(a)芘的定量限为0.45μg·L-1。

2.5 回收率及精密度

以炒制瓜子为试验样，准确称取1.0 g空白样品，进行1.00、5.00、10.00 ng·mL-13个浓度水平的加标回收试验。其中各个添加量的重复样品数为6个。按照本试验建立的方法添加标样量，各浓度测定值、回收率及相对标准偏差如表1所示，结果显示，回收率为80.4%～87.2%，相对标准偏差为3.5%～4.2%。

表1 各浓度测定值、回收率及相对标准偏差

2.6 实际样品测定

采集市场上不同种类炒制坚果30批次，按照本试验建立的方法进行检测。结果显示，22批次炒制坚果样品中都有不同程度苯并(a)芘检出，检出值0.5～2.3 μg·kg-1。

3 结论

本试验通过萃取剂、净化柱的选择及色谱条件的选择确立了高效液相色谱-荧光检测器测定炒制坚果中苯并(a)芘残留的方法。试验证明该方法简便灵敏，回收率高，操作简便，精确度高，适用于炒制坚果中苯并(a)芘的检测。本次研究表明，市面上的炒货坚果或多或少存在苯并(a)芘残留，虽含量不高，但考虑到苯并(a)芘的强致癌性，仍应引起重视。从坚果种植到坚果加工都应加强监管，减少苯并(a)芘残留。