茶叶对白色念珠菌体外抑菌活性的实验研究

郑明 黄晶晶 于皓 程辉

1. 350004 福州， 福建省高校口腔医学重点实验室， 福建医科大学附属口腔医院；2. 福建医科大学口腔医学院

白色念珠菌(Candidaalbicans)是一种寄生在人体的机会性致病真菌。近年来，随着类固醇激素等广泛应用，使临床上念珠菌感染日益增多[1-2]。研究表明65%以上义齿佩戴者患有念珠性口炎[3]，而白色念珠菌与念珠菌性口炎的发生密切相关[4]，其在患者的义齿菌斑中检出率81.7%，是主要的致病菌[5]。据调查，白色念珠菌也是临床感染率最高的真菌[6]。

茶叶作为纯天然的药物，饮茶的好处与人类健康的关系已有多方面研究。目前，对于茶叶的抗氧化活性[7]、抗癌活性[8-9]、抗微生物活性包括抗菌和抗病毒活性已广泛有报道[10-14]。关于茶叶抗真菌活性报道较有限。

据研究，绿茶的儿茶素，包括表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)具有抗真菌活性[15]。EGCG为一种抗叶酸化合物，可以扰乱白色念珠菌的叶酸代谢，从而达到抑真菌作用[16-17]。Sitheeque等[18]指出，红茶多酚(儿茶素和茶黄素)也显示抑制白色念珠菌能力。目前较多的究局限在对茶叶中的某一成分进行抗真菌研究，而以简单方法制取茶浸泡液对抗真菌是否有效鲜有报道。

同时，现有的义齿清洁剂对抗白色念珠菌效果有限[19]。所以，本实验通过3 种不同浓度的茶浸泡液对白色念珠菌的抑菌活性进行初步研究，为进而研究茶浸泡液是否能对义齿表面上真菌膜有清除作用做准备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 真菌株与茶叶 白色念珠菌标准菌株(ATCC90029，上海瑞楚生物科技有限公司)；白茶(AnG,浙江安吉)、铁观音(TM，福建安溪)、大红袍(HM，福建武夷山)。

1.1.2 主要试剂与仪器 培养基：琼脂粉(BIOSHARP)；液体沙氏培养基(青岛海博)；革兰染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；紫外分光光度计(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)。

1.2 方法

取20 g茶叶放入100 ml一级水(80～85℃)浸泡10 min，滤纸过滤，使用0.2 μm过滤器获得200 mg/mL无菌茶浸泡液。

采用对倍稀释法，用等量的沙氏液体培养基和等量的茶浸泡液混合配制成系列浓度对倍递减的茶浸泡液，再分别取上述系列浓度的茶浸泡液1 ml与 9 ml沙氏琼脂培养基混合后倾注平板。茶浸泡液平板浓度：20、10、5、2.5、1.25 mg/mL。每组平板样本量为10 个。

菌悬液配制：将白色念珠菌接种于沙氏琼脂培养基，恒温培养箱37 ℃培养48 h。挑取部分菌落革兰染色后，光学显微镜下观察菌落的形态，镜检为纯培养后挑取纯培养单菌落接种在沙氏液体培养基内，恒温摇床28 ℃，转速180 r/min培养24 h。离心(3 500 r/min，4 ℃，10 min)，弃上清液，PBS洗涤3 次。最后沉淀物用PBS稀释，配制104CFU/mL白色念珠菌菌悬液备用。取5 μl菌悬液分别点种于所有平皿表面，放入恒温培养箱在 37 ℃条件下培养48 h后，记录观察结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行分析，茶浸泡液抗菌活性采用单因素方差分析以及两两比较(以α=0.05作为显著性检验水平)。两两比较采用最小显著差数法(LSD法)。

2 结 果

以蒸馏水平板为空白对照组，除了10 mg/mL HM浸泡液平板菌落计数大于蒸馏水外，其余茶浸泡液平板均小于空白组。但只有10 mg/mL AnG浸泡液(P=0.025), 2.5 mg/mL HM浸泡液(P=0.046)与空白组之间相比有统计学意义，对白色念珠菌有抑制作用，其余茶浸泡液与空白组相比无统计学意义(表 1)。

组别平板浓度(mg/mL)细菌计数(1×104CFU/mL)空白组1.05±0.40AnG1.250.93±0.18AnG2.50.92±0.25AnG50.90±0.19AnG100.78±0.19①AnG200.97±0.18TM1.250.89±0.16TM2.50.95±0.31TM50.85±0.15TM100.80±0.26TM200.82±0.31HM1.250.83±0.20HM2.50.79±0.20①HM50.95±0.28HM101.10±0.31HM201.01±0.21

注： 与空白组比较，①P<0.05

3 讨 论

调查结果显示念珠菌感染占真菌感染的73.4%，其中白色念珠菌感染最为常见[20]。

本研究选择未发酵绿茶类中的安吉白茶，半发酵乌龙茶类中的铁观音、大红袍作为研究对象。选择这3 种茶叶是Chen等[21]对23 种茶浸泡液抗白色念珠菌活性进行研究，发现这3 种茶叶有一定的抗真菌活性。

为寻找对义齿表面上真菌膜有清除作用的茶浸泡液，本实验对这3 种茶叶的抗菌性进一步验证。与Chen等[21]采用的研究方法不同，采用药物敏感实验琼脂稀释法，并尝试更多不同茶浸泡液浓度进行抗白色念珠菌实验。

实验设置1.25、2.5、5、10、20 mg/mL 5 种跨度较大等比系列茶叶浓度，试图找到抑制白色念珠菌的最佳茶叶浓度。本实验研究证实10 mg/mL AnG浸泡液, 2.5 mg/mL HM浸泡液对白色念珠菌有抑制作用，其余茶浸泡液及不含茶浸泡液对白色念珠菌的生长无显著影响。 Chen等[21]的实验结果这3 种茶叶在1.25 mg/mL时达到50%白色念珠菌抑制率。推测可能是因为采用的研究方法不一样，该学者采用液体法，本实验采用琼脂稀释法，以及茶浸泡液制取方法不一样导致结果差异。

通过本研究了解到茶叶浸泡液对白色念珠菌有一定抑制作用，喝茶或用茶清洗口腔，可能有助于减少口腔真菌感染。茶提取物可能是潜在义齿消毒产品的原材料。另外，茶浸泡液对白色念珠菌的抑菌作用与浓度有关，且抑菌能力不随浓度增加而增强。可对不同浓度的茶浸泡液抑菌活性进一步研究。