SMAS修饰的PEGDA载电凝胶对MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响

马廷廷 张漫 朱佳妮 王卫卫 刘杰 谈飞

266003， 青岛大学附属医院口腔修复科

PEGDA凝胶的内部结构与天然细胞基质(ECM)相似，已被广泛应用于生物医学领域[1-2]。但因其本身的生物惰性，导致细胞在凝胶表面难以粘附。随着研究的深入，诸多学者发现材料表面负电荷可以促进细胞在材料表面的粘附。甲基丙烯酸磺酸钠(SMAS)是含有稳定负电荷的小分子，能够保证修饰后材料表面的电量。本研究用不同浓度的SMAS修饰PEGDA凝胶，研究材料表面电荷对细胞增殖和分化的影响。

1 材料与方法

1.1 SMAS修饰凝胶的制备

载电凝胶的制备见表 1。将凝胶前体溶液混匀后滴至无菌玻璃板上，用365 nm紫外线光固化灯照射15～20 min使其完全固化，制成样品，每组6 块。

表 1 不同浓度SMAS修饰凝胶的制备

1.2 SMAS修饰凝胶的化学结构分析

将样品冻干24 h，利用红外光谱 FTIR分光仪分析不同浓度SMAS修饰的 PEGDA 凝胶化学结构的变化，得出SMAS接枝量的差异。

1.3 SMAS修饰凝胶的Zeta电位测定

将各组样品于三蒸水中浸泡48 h，用研钵将溶胀的凝胶研磨成细小颗粒，37 ℃真空干燥过夜，各组称取5 mg，重新溶解至三蒸水，混匀后利用Zeta电位仪测量各组凝胶Zeta电位。

1.4 细胞增殖情况测定

常规培养MC3T3-E1细胞，将MC3T3-E1细胞悬液以1×105密度接种于凝胶表面。在1、 3、 5 d用CCK8法，记录各组样本A值。

1.5 细胞ALP活性的影响

细胞在凝胶表面诱导培养后，分别于7、 10、 14 d， 利用ALP检测试剂盒检测各组细胞的ALP活性。

1.6 细胞成骨分化相关基因检测

在各组凝胶表面接种细胞。待细胞覆盖凝胶表面95%时，换成骨诱导培养基。分别于7、 14、 21 d， 提取各组样本RNA，采用qRT-PCR检测成骨相关基因表达水平。相关相引物序列见表 2。

表 2 成骨相关引物序列表

1.7 钙盐含量检测

第21 天，用茜素红染色的方法对各组水凝胶表面细胞的钙盐含量做定量分析。

2 结 果

2.1 SMAS修饰凝胶的化学结构分析

FTIR光谱如图1所示。SMAS成功接枝到PEGDA主链上，在1 105 cm-1处出现一个新的波峰，且随着SMAS浓度的增加波峰逐渐增强。

图 1 不同浓度SMAS小分子修饰的PEGDA凝胶表面的傅立叶红外光谱分析

2.2 SMAS修饰凝胶Zeta电位分析

图 2为Zeta电位绝对值，随着SMAS浓度的增加，凝胶所携的负电荷的电量也明显增加。

2.3 SMAS修饰凝胶对MC3T3-E1细胞增殖的影响。

CCK-8结果表明，在各个时间点，凝胶表面的MC3T3-E1细胞增殖活性均不断增加(图 3)。

2.4 SMAS修饰凝胶对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响

结果表明，随着SMAS浓度的提高，凝胶表面细胞的ALP相对活性不断增强(图 4)。

2.5 SMAS修饰凝胶表面MC3T3-E1细胞成骨相关基因的检测

结果如图 5，COLI和OC在HG200组表达水平均明显高于HG0组(P<0.05)。在成骨相关生长因子方面，在各个时间点，BMP-2、 TGFβ1和Runx-2在HG200组的表达水平均明显高于HG0组(P<0.05)；而在第21 天， HG100组凝胶表面细胞的成骨生长因子表达水平也明显高于HG0组(P<0.05)，且差异具有统计学意义。

2.6 SMAS修饰凝胶对MC3T3-E1细胞钙盐含量的影响

茜素红染色结果如图 6所示，随着SMAS浓度的增加，染色的矿化结节数量逐渐增加，HG200组深色区域几乎覆盖整个凝胶表面。半定量分析结果表明(图 6E)，HG100和HG200组钙盐含量明显高于HG0组(P<0.05)，差异具有统计学意义。

3 讨 论

SMAS小分子一端带有稳定负电荷，另一端含有2-甲基丙烯酰基，该基团可以与聚合物中的多种基团发生反应，从而接枝到聚合物主链上。FTIR结果显示，在1 105 cm-1处的波峰不断增强，该波峰是由SMAS的羧酸基团引发的，证明SMAS成功接枝到PEGDA凝胶的主链上。同时凝胶表面电荷量也明显增加。在本研究中，发现凝胶表面电荷能够有效促进细胞的增殖以及成骨相关标志性蛋白和生长因子的表达，说明表面电荷能够有效促进细胞的成骨分化。ALP是成骨早期标志性蛋白之一，对早期骨基质矿化具有重要影响。 COLⅠ成骨中期标志性蛋白之一，能够与ECM中多种非胶原蛋白结合并构成骨基质的骨架[3]。OC是由成熟的成骨细胞分泌的成骨晚期标志性蛋白之一，能够促进羟基磷灰石晶体的生成，对骨基质的矿化具有调节作用[4-6]。BMP-2和TGFβ1是当前公认的具有骨诱导作用的生长因子之一[7]。大量研究表明， 2 种生长因子具有共协调作用，能够有效诱导骨祖细胞的募集，促进骨祖细胞的增殖和成骨分化。Runx-2是细胞成骨分化过程中一个重要的逆转录因子，它在矿化的多个时期发挥调节作用，在成熟的骨组织中高度表达[8]。

图 2 SMAS修饰水凝胶Zeta电位绝对值 图 3 SMAS修饰水凝胶表面细胞增殖检测 图 4 SMAS修饰水凝胶表面细胞ALP活性检测

图 5 SMAS修饰凝胶表面细胞成骨分化相关基因RT-PCR结果半定量分析

图 6 各组凝胶表面的茜素红染色结果

本实验的结果表明，HG100、HG200组凝胶能够有效促进细胞的增殖和分化而这种促进作用主要与材料表面电量有关。因此，载电凝胶是一种前景良好的骨组织工程支架材料。