叶酸壳聚糖纳米粒携带DAC影响SCC-9细胞p16基因甲基化状态的意义

刘雪莹 彭欢 林曦 徐华生 黄旋平

p16 基因已被证实参与了细胞的周期调控，肿瘤的发生与其失活导致相关蛋白蛋白合成减少密不可分。p16基因甲基化是p16基因失活的主要方式，造成了肿瘤的发生。该文在实验中选择了具有逆甲基化及抑制甲基化的5-氮-2’-脱氧胞苷(地西他滨,DAC)，未配备载药系统的DAC有效性差，主动吸附靶标的几率小。叶酸受体被证实大量存在于恶性肿瘤细胞中，所以鉴于这些特点利用叶酸壳聚糖纳米颗粒携DAC以提高有效性。本实验探索叶酸-壳聚糖携DAC纳米粒对比DAC作用于人鳞状上皮舌癌细胞SCC-9细胞p16基因甲基化还原效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料

SCC-9细胞(上海酶研生物科技有限公司)；DAC(上海源叶生物科技有限公司)；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(TaKaRa公司,日本);甲基化荧光PCR试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)、p16基因引物(大连宝生物公司)；Human β-actin (北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；一抗p16/mts1抗体、二抗兔抗人kit、DAB显色剂(中衫生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养

10%血清DEMN培养基，贴壁培养SCC-9细胞培养于37 ℃、5%CO2培养箱，2～3 d换液并适时传代，待其处于生长对数期备用。

1.3 叶酸壳聚糖载药DAC纳米颗粒制备

100 mg叶酸加合适剂量的蒸馏水，搅动下逐滴加入氨水；0.45 μm滤膜过滤，蒸馏水定容至100 ml，得叶酸氨盐溶液。400 mg壳聚糖加合适剂量的蒸馏水与2 ml冰醋酸磁力搅拌，醋酸的浓度应为1%。0.45 μm滤膜过滤与蒸馏水配至200 ml获2 mg/ml壳聚糖醋酸。合适剂量DAC与已配置的200 ml的壳聚糖醋酸液混合以1 000 r/min速度磁力下进行搅拌，加入50 ml叶酸氨盐溶液与20 ml 2 mg/ml三聚磷酸钠溶液，均按1 滴/s的速度，获得载药地西他滨的叶酸-壳聚糖纳米粒水分散体系。合理稀释，用Malvern ZETASIZER NANO检测其粒径和电位，平均粒径为212 nm，电位均值为30.8 mV，证实其为稳定的纳米粒子。

1.4 实验分组

将体外培养的SCC-9细胞分为0、1、2、3、4、5、6组，其中1、2、3组选用3 个梯度浓度1×10-7mol/ L、1×10-6mol/ L、1×10-5mol/L的DAC进行处理细胞，4、5、6组采用同样3 个浓度梯度叶酸壳聚糖载药DAC纳米粒处理细胞，0组为空白对照组。

1.5 p16基因mRNA的表达

依照实验说明书所示步骤提取各组药物处理了的Total RNA，反转录试剂盒说明步骤合成Real-time PCR反应用模版cDNA。p16基因mRNA上游引物序列：5’-CCCCACTACCGTAAATG TCCA-3’下游引物序列：5’-TGCTCACTCCAGAAAACTCCAA-3’。内参β-actin引物序列正义链引物序列：5’-GCCTCGCTGTCCACCTTCCA-3’反义链引物序列：5’-CACCTTCACCGTTCC AGTTT-3’。PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共循环40 次，72 ℃延伸5 min。溶解曲线反应体系以PCR仪器的推荐体系设定。用ΔΔCt法处理结果，ΔΔCt=Ct实验组(Ct实验组p16-Ct实验组β-actin)-ΔCt空白对照组(Ct空白对照组p16-Ct空白对照组β-actin)。2-ΔΔct>1即为目的基因高表达。

1.6 p16蛋白表达

各组按剂量放入培养基内在孔板内培养细胞48 h。4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3 次，浸泡0.1%Triton-x-100室温10 min，PBS洗3 次后滴中杉封闭血清37 ℃孵育15 min，倾去。滴加一抗、二抗。空白对照组分为2 组分别滴加一抗、二抗及PBS。DAB显色(避光，镜下观察至棕色)约3～10 min，蒸馏水洗2 次，苏木素复染0.5～1 min，水洗 30 min，树胶封片。镜下随取12 个100 倍视野，根据细胞染色计分，棕褐色3 分，黄色2 分，浅黄色1 分，无色0 分，≥70%记3 分，30%～69%记2 分，1%～29%记1 分，无为0 分。分数相加为结果：0 分为阴性；1～2 分为低表达；3 分以上为高表达。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC与DAC作用SCC-9细胞后p16基因mRNA表达

药物作用48 h后，实验组均2-ΔΔcr>1 (P<0.05)，叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC组的p16基因mRNA的表达与DAC组相比有着明显差异(P<0.05)，表明叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC在一定程度上，更有效的上调了p16基因的表达(表 1)。Real-time PCR SCC-9细胞p16基因mRNA实时荧光定量PCR扩增曲线图(图 1)和SCC-9细胞p16基因mRNA实时荧光定量PCR扩增曲线(图 2)，排除非特异性扩增及引物二聚体。实验组加药后SCC-9细胞p16基因表达2-ΔΔct值和各实验组加药48 h后p16基因的mRNA相对表达量(表 1)。

药 物 浓 度2-ΔΔct值DAC处理48 h 1×10-7 mol/L3.58±0.15DAC处理48 h 1×10-6 mol/L20.88±0.11DAC处理48 h 1×10-5 mol/L5.89±0.23载药DAC处理48 h 1×10-7 mol/L9.12±0.13载药DAC处理48 h 1×10-6 mol/L23.96±0.24载药DAC处理48 h 1×10-5 mol/L10.12±0.18未加药DAC处理48 h1

2.2 加药作用SCC-9细胞后p16蛋白免疫组化结果(×100倍)

p16基因细胞核或细胞质呈棕黄色为p16蛋白的阳性表达,4、5组较相同浓度的1、2组p16蛋白均呈高表达状态， 即在1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L 3 个浓度下， 1×10-7mol/L、1×10-6mol/L叶酸壳聚糖纳米粒载药DAC对比相对应浓度的DAC组呈强阳性表达，1×10-5mol/L对照组叶酸壳聚糖纳米粒载药DAC对比相同浓度的DAC组为弱阳性表达，空白组为阴性表达(图 3)。

图 1 SCC-9细胞p16基因mRNA实时荧光定量PCR扩增曲线 图 2 SCC-9细胞p16基因mRNA实时荧光定量PCR溶解曲线

Fig 1 p16 gene mRNA Real-time PCR amplification curve of SCC-9 cells Fig 2 p16 gene mRNA Real-time PCR melt curve of SCC-9 cells

图 3 SCC-9细胞p16蛋白阳性表达 (IHC, ×100)

Fig 3 The expression of p16 protein in SCC-9 cells (IHC, ×100)

3 讨 论

目前恶性肿瘤的发病率居高不下[1]，Serrano等[2]证明了p16基因的产物的减少会导致细胞进入无限增殖，是细胞生长关键因子。p16基因甲基化引起了转录失活导致p16产物表达可减弱甚至消失极大地增加肿瘤发生的可能[3]。DNA甲基化修饰是DNA去甲基化酶与DNMT通过正负调控共同维持的一种动态平衡的DNA甲基化模式。已有研究证明在癌细胞系中，去甲基化试剂可以使高甲基化表达的基因去甲基化从而恢复表达[4]。5-aza-CdR ，即DAC(decit-abine)，诱导DNA基因去甲基化，促进启动子区域的去甲基化[5]。但现在地西他滨用药有效性差，靶向性弱，主动吸附靶标的几率小，化疗毒副作用强，因此造成患者心理和身体的双重折磨。

壳聚糖因其良好的生物兼容性，无免疫原性并且具有优良的黏膜粘附特性[6]，因此制备多种壳聚糖衍生物药物运载系统等范畴有着光明的应用远景[7-8]。叶酸(FA)是很多生物所需的一种必要维他命，叶酸受体在多数恶性肿瘤细胞膜内大量存在，远远高于普通细胞[9]，这种受体是锚在膜上一种通过聚糖磷脂酰肌醇(GPI)，是具有高度特异的亲合性的糖蛋白，具有将叶酸通过吞噬作用在生理条件下摄取入细胞内能力。所以鉴于这些特点将叶酸壳聚糖载药纳米颗粒作为抗肿瘤药物的载药系统以便提高有效性。Ji等[10]报道了利用叶酸-共轭壳聚糖包覆卡铂用于治疗宫颈癌，结果显示该载药系统具有更加优越的靶向细胞毒性，提示我们该载药系统在舌癌治疗方面很可能具有治疗价值。

本课题组已证实DAC可以促使p16基因逆甲基化从而恢复活性重新编码p16蛋白[11]。本实验通过Real-time PCR检测p16基因mRNA表达结果显示，经过叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC组和DAC组处理48 h后，叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC组p16基因mRNA呈高表达，相对表达量RQ值均大于1，各叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC组分别与相同浓度下DAC组进行t检验(均P<0.05)，差异有统计学意义。因此可以推断，在SCC-9细胞中，p16基因为高甲基化状态，叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC更有效的促使部分p16基因发生了去甲基化作用，使其重新恢复了活性，从而上调了mRNA的表达。本实验中免疫组化结果显示，叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC与DAC作用培养48 h后的SCC-9细胞，其p16蛋白实验组均呈高表达状态，叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC组相较于未配备载药系统组更是呈强阳性表达，这与p16基因表达的改变相对应。

本次实验证实了叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC更有效的发挥了DAC的去甲基化作用，且叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC组对比DAC组在SCC-9细胞中p16基因的蛋白及mRNA表达均增高。可以认为叶酸壳聚糖纳米颗粒载药DAC更有效的利用了甲基化转移酶抑制原理，对舌癌的治疗具有指导意义。