Livin在结肠癌中的表达及与上皮-间质转化的关系

张骞，韩艳春，曹璋，于洋，张艳智，马莉，赵塞

（1滨州医学院附属医院病理科，滨州 256603；2滨州医学院病理学教研室，烟台 264003）

结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和致死率仍然高居不下，尤其是发病率还在不断增加。复发和转移是导致结肠癌患者死亡的主要因素。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是结肠癌浸润和转移的关键机制之一。因此研究结肠癌EMT发生的分子机制，对于改善预后，提高患者的生存率至关重要。Livin是凋亡抑制蛋白家族的重要成员，可促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。Li等[1]报道livin在乳腺癌组织中表达升高并诱导肿瘤细胞的上皮-间质转化过程，从而促进肿瘤的侵袭转移。而livin与结肠癌组织EMT表型的关系目前尚未见报道。为此，我们研究了结肠癌组织中livin和EMT表型的表达情况及其临床意义，并探讨了livin和EMT之间的关系。

材料与方法

1 临床资料

70例结肠癌组织标本取自滨州医学院附属医院病理科存档的蜡块。所有患者均经手术切除治疗，术前未接受放疗或化疗等治疗。其中男性结肠癌患者 38例，女性结肠癌患者32例。肿块直径≥5cm者42例，肿块直径＜5cm者28例。肿瘤浸润至肌层者29例，肿瘤浸润达浆膜者41例。依据WHO分级和分期标准：高中分化程度者34例，低和未分化程度者36例；I+Ⅱ期者31例，Ⅲ+Ⅳ期者39例。未发生淋巴结转移的结肠癌患者30例；发生淋巴结转移的结肠癌患者40例。用于Western blot检测的8例新鲜结肠癌组织标本收集后即刻置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

2 试剂

兔抗人livin、E-cadherin抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；兔抗人vimentin、N-cadherin抗体购于北京博奥森生物科技有限公司；鼠抗人单克隆GAPDH抗体、增强酶标山羊抗兔IgG、免疫组织化学试剂盒、DAB显示试剂盒、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物公司；ECL发光试剂购于Thermo公司。

3 免疫组织化学

收集来的结肠癌组织蜡块标本均制成4μm厚的组织切片，置于枸橼酸盐缓冲液中煮沸进行抗原修复，Envision法免疫组织化学染色。一抗用PBS缓冲液来代替作为阴性对照，而已知阳性的结肠癌组织切片则用来作为阳性对照。第一抗体livin（1∶100）、E-cadherin （1∶ 300）、vimentin（1∶ 300）和N-cadherin（1∶ 300）4℃孵育过夜。次日滴加增强酶标山羊抗兔IgG二抗，室温孵育30 min，DAB显色，苏木素复染。结果判定：livin主要于细胞核内表达，按着色细胞数量的比例划分为5个等级：无着色为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；依据染色强度又划分为4个等级：无染色者为0分，染为淡黄色者为1分，染为黄色或棕黄色者为2分，染为棕褐色者为3分。最后的IHC总分=着色细胞比例得分×染色强度得分，得分≥2定为livin表达阳性。E-cadherin主要表达于细胞膜，＞50%的细胞呈现出棕黄色颗粒记为表达阳性；N-cadherin表达于细胞膜和（或）细胞质内，＞10%的细胞呈现出棕黄色颗粒记为表达阳性；vimentin主要在间质细胞中表达，若在结肠腺上皮细胞中＞10%的细胞有着色记为表达阳性。

4 Western blot分析

以RIPA裂解液加入到新鲜的结肠癌组织中处理组织样本，提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白浓度测定。以60μg总蛋白加入到电泳上样孔道中，于10% SDS-PAGE中电泳，将电泳分离的蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入兔抗livin、E-cadherin、vimentin、N-cadherin抗 体（ 均1∶500）4℃冰箱中过夜。次日，分别以相应羊抗兔IgG（1∶ 1500）室温孵育2h，用ECL显影后凝胶成像分析系统（美国Bio-Image system UVP公司）拍照。结果用Image J软件进行条带光密度值测定，以与内参GAPDH（1∶1500，北京中杉金桥生物公司）的比值作为各指标的相对表达量。

5 统计学分析

应用SPSS 16.0统计学软件进行分析，采用χ2检验分析livin与结肠癌临床病理特征的关系，用Pearson相关检验对livin表达与EMT标志蛋白的免疫组化结果进行相关性分析，采用t检验分析统计组间的差异，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

1 Livin在结肠癌组织中的表达

免疫组织化学检测70例结肠癌组织和相应癌旁正常结肠黏膜组织中livin免疫反应性显示，结肠癌组织中livin主要于结肠癌癌细胞核内呈阳性表达（图1）。结肠癌组织中livin的表达阳性率61.4%（43/70），显著高于相应癌旁正常结肠黏膜组织中livin的表达阳性率8.6%（6/70）。

2 Livin与结肠癌患者的临床病理特征的关系

对免疫组织化学检测的livin表达与70例结肠癌患者的临床病理特征进行统计学分析显示，TNMⅢ+Ⅳ分期的结肠癌患者组织中livin阳性表达率明显高于TNMI+Ⅱ分期的患者；发生淋巴结转移的结肠癌患者组织中livin阳性表达率明显高于未发生淋巴结转移者；而Livin阳性表达与结肠癌患者的年龄、性别、肿瘤的大小、肿瘤的组织学分级和TNM分期差异没有显著统计学意义（表1）。

图1 Livin在结肠癌及癌旁组织中表达的免疫组织化学检测。A，在结肠癌中呈阳性；B，在癌旁组织中呈阴性；比例尺，50µmFig.1 Immunohistochemical examination on the expression of livin in colorectal cancer and adjacent normal tissues. A, livin was strongly positive in colorectal cancer tissues; B, livin was negative in adjacent normal colorectal tissues; scale bar, 50µm

表1 Livin表达与结肠癌患者临床病理特征的关系Tab. 1 Correlation between livin expression and clinicopathological features of patients with colorectal cancer

3 结肠癌组织中Livin与E-cadherin、vimentin、N-cadherin表达之间的关系

免疫组织化学检测的70例结肠癌组织中E-cadherin、vimentin、N-cadherin的表达情况为：E-cadherin主要定位于结肠癌癌细胞膜，35.7%（25/70）呈阳性表达；vimentin主要定位于结肠癌癌细胞胞质内，32.9%（23/70）呈阳性表达；N-cadherin主要定位于结肠癌癌细胞胞质内，60%（42/70）呈阳性表达（图2）。对livin与E-cadherin、vimentin、N-cadherin的表达应用Pearson相关检验进行相关性分析表明：livin与E-cadherin表达呈负相关，与vimentin和N-cadherin表达呈正相关（表2）。Western blot检测显示，livin高表达的结肠癌组织中，E-cadherin呈低表达，vimentin和N-cadherin呈高表达（图3）。

表2 Livin与结肠癌EMT标志蛋白表达的关系Tab. 2 Correlation between livin and EMT marker proteins in colorectal cancer

图2 E-cadherin、vimentin和N-cadherin在结肠癌组织中的表达。A，E-cadherin 胞膜（-）；B，vimentin 胞质（+）；C，N-cadherin 胞质（+）；比例尺，50µmFig. 2 Expression of E-cadherin, vimentin and N-cadherin in colorectal cancer tissues. A, negative E-cadherin in plasma membrane (-); B, positive vimentin in cytoplasm (+); C, positive N-cadherin in cytoplasm (+); scale bar, 50µm

图3 Livin、E-cadherin、vimentin、N-cadherin在结肠癌组织中表达的Western blot检测。L，livin低表达的结肠癌组织；H，livin高表达的结肠癌组织Fig. 3 Western blot analysis of livin, E-cadherin, vimentin and N-cadher expressions in colorectal cancer tissues. L, colorectal cancer tissue with low expression of livin; H, colorectal cancer tissue with high expression of livin

讨 论

上皮间质转化时，细胞形态由上皮细胞向间质细胞转化，上皮性肿瘤细胞的上皮标志物如上皮钙黏蛋白（E-cadherin），细胞角蛋白（cytokeratin）等减少，细胞骨架蛋白等间质标志物如波形蛋白（vimentim)、神经钙黏蛋白（N-cadherin）、纤连蛋白（fibronectin）等增加，因此，可以通过检测这些标志物来鉴定EMT的发生[2-4]。EMT是上皮源性肿瘤细胞转变为高侵袭性表型的关键步骤，同时也是肿瘤细胞发生转移的重要前提条件之一。EMT发生使得结肠癌细胞侵袭能力增强，但目前结肠癌EMT发生的机制尚未阐明。

Livin又称为ML-IAP或KIAP，是凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成员。IAP家族在细胞生长，肿瘤进展等方面发挥了重要作用，一些凋亡抑制因子已经进入临床实验阶段[5-7]。以往研究发现，livin与肝癌、乳腺癌、结直肠癌等多种人类恶性肿瘤的转移有关[8-11]。Wang等[12]研究表明，livin在结直肠癌中表达增强，并与结肠癌的转移和不良预后有关。然而，livin与结肠癌转移的机制仍需进一步研究。我们实验结果表明，livin在TNM分期高的结肠癌中的表达高于在TNM分期低的结肠癌中的表达，而且发生淋巴结转移的结肠癌患者组织中livin蛋白表达水平高于未发生淋巴结转移者，提示Livin表达增强可能对结肠癌的侵袭和转移进展有重要的促进作用，这可为结肠癌的治疗提供一个新的研究基础。

有报道livin在乳腺癌中呈高表达，并可诱导乳腺癌细胞EMT发生，从而促进乳腺癌的侵袭转移[1]。我们的实验结果表明，livin与E-cadherin表达呈负相关，与N-cadherin和vimentin表达呈正相关；并且通过Western blot检测也发现livin高表达的结肠癌组织中，E-cadherin呈低表达，vimentin和N-cadherin呈高表达。以上结果提示livin与结肠癌的EMT表型有关，livin可能通过下调E-cadherin，上调vimentin和N-cadherin介导EMT发生，从而促进结肠癌细胞的侵袭转移。如果能够抑制livin，有可能阻止肿瘤细胞从原发部位脱离和侵袭转移。但结肠癌的侵袭转移是个复杂的过程，本实验研究仅从组织水平初步验证livin和EMT表型有关，livin是通过什么途径调控EMT表型的改变需要进一步深入的研究。