上调miR-200c通过抑制TGF-β1/Smad3通路减轻单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化

任德伟，钟锦 ，杨敬

（重庆市中医院肾内科，重庆40000）

肾纤维化是各种慢性肾脏疾病进展到终末期肾病的共同途径，是由多种细胞因子介导、多信号通路参与的病理过程，以细胞外基质成分过度沉积和肾间质成纤维细胞增生导致的肾脏结构破坏、功能丧失为特征[1]。微小RNA（microRNA, miRNA）是一类短链小分子非编码RNA，广泛参与肾脏的生理和病理过程[2]。miR-200c是miR-200家族重要成员之一，其位于染色体12p13.31上，较多的研究发现，器官纤维化时miR-200c表达明显下调，如miR-200c在肺[3]、腹膜[4]、皮肤[5]等器官纤维化时表达均明显降低，但至今有关miR-200c与肾脏纤维化关系的研究甚少，并且作用机制尚不清楚。TGF-β/Smad信号通路与脏器纤维化的关系密切，TGF-β1和Smad3是TGF-β/Smad信号通路最重要的调控因子，在脏器纤维化中起促进作用[6,7]。研究证实miR-200c可以调控TGF-β1/Smad3信号通路参与机体生理和病理过程[8]。单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstmction,UUO）可以导致实验动物模型出现肾纤维化，是目前研究肾纤维化最常用的方法[9]。本研究通过建立UUO肾间质纤维化小鼠模型，观察miR-200c在UUO小鼠肾组织中的表达变化及其对UUO小鼠肾间质纤维化和TGF-β1/Smad3通路的影响。

材料与方法

1 实验动物

健康雄性SPF级C57BL/6J小鼠45只，体重21～26g，购自重庆医科大学动物实验中心。于室温安静环境下常规饲养，昼夜交替，自由饮食饮水，适应环境1w。本研究中所有动物的实验操作均符合动物伦理学标准。

2 药物与试剂

Scr和BUN 测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；Allin-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit购自广州复能基因有限公司；agomir-200c、miR-200c和U6引物购自上海生工生物工程公司；Masson 染色试剂盒购自福州迈新生物公司；一抗TGF-β1、Smad3、α-SMA抗体、GAPDH抗体和HRP标记的二抗均购自美国Santa Cruz公司。

3 UUO模型制备、分组及取材

所有C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为假UUO组、UUO组、UUO+agomiR-200c组，每组15只。UUO组和UUO+agomiR-200c组参考文献[10,11]通过结扎左侧输尿管建立的肾纤维化模型：5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，切开腹腔暴露左肾，游离左输尿管，于肾门处结扎输尿管，于输尿管的远离肾门处二次结扎，在两处结扎中间离断输尿管后缝合腹腔。假UUO组仅游离左侧输尿管，但不进行结扎和离断输尿管的操作；手术操作均严格按无菌原则进行。UUO+agomiR-200c组于手术后第1、7、14d给予30mg/kg的agomir-200c尾静脉注射，UUO 组以等量生理盐水尾静脉注射。在建立模型后21d麻醉处死所有小鼠，心脏取血，用于测定SCr和BUN。取小鼠梗阻侧肾脏组织，留取一半肾组织，4%甲醛溶液固定，用于病理染色；剩余组织置于液氮中速冻后置于-80℃低温冰箱保存，用于qRT-PCR和Western blotting的检测。

4 血测定血肌酐和血尿素氮检测

麻醉处死小鼠后心脏取血，离心取上层血清，全自动生化分析仪检测血测定血肌酐（Scr）、和血尿素氮（BUN）的水平。

5 qRT-PCR检测肾组织miR-200c的表达

取冻存的小鼠肾组织匀浆后，RNA的抽取按照TRIzol试剂说明书进行，并使用紫外分光光度计测定总RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳测定总RNA质量。取总RNA，按照cDNA合成试剂盒说明书操作逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，参照qPCR试剂盒说明书配置PCR体系后，应用实时定量PCR仪进行qPCR,PCR循环条件：95℃，10min；45个循环（95℃，10s，60℃，20s，72℃，10s）。以 U6作为内参基因，采用2-△△Ct法计算miR-200c相对表达量。

6 肾组织病理性检查

肾组织经4%甲醛固定，常规酒精脱水、二甲苯透明，石蜡包埋后切5μm厚石蜡片，经过脱蜡、浸泡等常规处理后HE染色及Masson染色，光镜下观察肾脏组织的病理学改变。肾小管间质损伤病理评分采用半定量标准进行评分[12], 进行半定量分析，评分标准如下：0分，肾小球无病变；1分，肾小球病变面积＜25%；2分，肾小球病变面积25%～50%；3分，肾小球病变面积51%～75%；4分，肾小球病变面积＞75%。参考文献[13]依据Masson染色结果每例切片随机选取10个肾小管间质不重复视野，计算胶原容积分数（CVF），蓝色胶原沉积为Masson阳性染色，CVF=胶原面积/肾间质总面积，肾间质总面积为除去肾小管管腔面积后的肾间质面积。

7 Western blotting检测肾组织TGF-β1、Smad3及α-SMA水平

取冻存的小鼠肾组织用RIPA裂解，离心取裂解上清液，二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白浓度定量。蛋白上样，SDS-Page电泳，电转移至PVDF膜。室温脱脂奶粉封闭1h后加入一抗（TGF-β1、Smad3、α-SMA抗体及GAPDH抗体）, 4℃孵育过夜，TBST洗3次后再加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，洗涤3次后，ECL显像曝光后凝胶成像系统采集图像，采用Quality one进行条带光密度值测定，应用GADPH作为内参，以目的条带光密度值与内参条带光密度值的比值表示蛋白相对水平。

8 统计学方法

数据采用SPSS 19.0进行统计分析，计量资料以（¯x±s）表示，比较采用单因素方差分析及t检验，P＜0.05表示为差异有统计学意义。

结 果

1 单侧输尿管梗阻降低肾组织中miR-200c表达水平

为了观察单侧输尿管梗阻性小鼠肾组织中miR-200c的表达变化，应用qRT-PCR检测肾组织miR-200c表达水平。结果显示，与假UUO组比较，UUO组小鼠肾组织miR-200c的表达水平较假UUO组明显降低；UUO+agomiR-200c组小鼠肾组织miR-200c的表达明显高于UUO组（图1）。由此表明，agomiR-200c能够纠正UUO小鼠肾组织中miR-200c表达的降低。

2 过表达miR-200c减轻单侧输尿管梗阻性肾功能损伤

为了观察过表达miR-200c对单侧输尿管梗阻性肾功能损伤的影响，应用全自动生化分析仪检测血清Scr和BUN，结果显示，与假UUO组比较，UUO组小鼠血清Scr和BUN水平较假UUO组明显升高，UUO+agomiR-200c组小鼠血清Scr和BUN水平明显低于UUO组（表1）。由此表明，过表达miR-200c能减轻单侧输尿管梗阻性肾功能损伤。

图1 单侧输尿管梗阻对肾组织中miR-200c表达的影响。A，假UUO组；B，UUO组；C，UUO+agomiR-200c组；与假UUO组比较：#P＜0.01；与UUO组比较：*P＜0.01Fig.1 The effect of unilateral ureteral obstruction on the expression level of miR-200 in renal tissue. A, Sham UUO group; B, UUO group;C, UUO+agomiR-200c group; #, P＜0.01, compare with the sham UUO group; *, P＜0.01, compare with the UUO group

表1 过表达miR-200c对单侧输尿管梗阻性肾功能损伤的影响Tab. 1 The effect of miR-200c upregulation on the renal functions of mice with unilateral ureteral obstruction

3 过表达miR-200c降低单侧输尿管梗阻小鼠肾小管间质损伤病理评分及肾胶原容积分数

肉眼观，假UUO组小鼠肾脏形态色泽正常，左肾（梗阻侧肾）与右肾无明显差别。UUO组和UUO+agomiR-200c组小鼠左肾（梗阻侧肾）表面血管增粗，包膜紧张，左肾明显大于右肾，并且左肾较右肾颜色变浅；UUO+agomiR-200c组小鼠肾脏形态学改变较UUO组明显减轻。

HE染色显示，假UUO组小鼠肾小球、肾小管及肾间质正常，未见明显损伤表现；UUO组小鼠肾脏可见肾小管管腔扩张明显，肾间质增宽，大量炎性细胞浸润；UUO+agomiR-200c组小鼠肾脏病理性改变较UUO组明显减轻（图2）。计算肾小管间质损伤病理评分结果显示：与假UUO组比较，UUO组小鼠肾小管间质损伤病理评分较假UUO组明显增加；UUO+agomiR-200c组小鼠肾小管间质损伤病理评分明显低于UUO组（图3）。由此表明，过表达miR-200c能降低单侧输尿管梗阻性小鼠肾小管间质损伤病理评分。

图2 过表达miR-200c对小鼠单侧输尿管梗阻性肾病理变化影响的HE染色检测。A，假UUO组；B，UUO组；C，UUO+agomiR-200c组；比例尺，50μmFig. 2 HE staining to observe the effect of miR-200c upregulation on the pathological changes of renal tissues in mice with unilateral ureteral obstruction. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group; scale bar, 50μm

图3 肾小管间质损伤病理评分。A，假UUO组；B，UUO组；C，UUO+agomiR-200c组；与假UUO组比较：#P＜0.01；与UUO组比较：*P＜0.01Fig. 3 Pathological score of renal tubulointerstitial injury. A, Sham UUO group; B, UUO group; C，UUO+agomiR-200c group; #, P＜0.01, compare with the sham UUO group; *, P＜0.01, compare with the UUO group

Masson染色检测显示，假UUO组小鼠肾组织Masson阳性染色正常，主要分布于肾小管基膜、系膜区和肾小管毛细血管周围；UUO组小鼠肾间质中胶原纤维（蓝染）明显增多；UUO+agomiR-200c组小鼠肾间质中胶原纤维（蓝染）较UUO组明显减少（图4）。计算肾胶原容积分数（CVF）结果显示：与假UUO组比较，UUO组小鼠CVF较假UUO组明显增加；UUO+agomiR-200c组小鼠CVF明显低于UUO组（图5）。由此表明，过表达miR-200c能降低单侧输尿管梗阻性小鼠肾胶原容积分数。

图5 Masson染色胶原容积分数。A，假UUO组；B，UUO组；C，UUO+agomiR-200c组；与假UUO组比较：#P＜0.01；与UUO组比较：*P＜0.01Fig. 5 Collagen volume fraction in Masson staining. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group; #, P＜0.01, compare with the sham UUO group; *, P＜0.01, compare with the UUO group

图4 过表达miR-200c对小鼠单侧输尿管梗阻性肾病理变化影响的Masson染色检测。A，假UUO组；B，UUO组；C，UUO+agomiR-200c组；比例尺，50μmFig. 4 Effect of miR-200c upregulation on the pathological changes of renal tissues examined by Masson staining in mice with unilateral ureteral obstruction. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group; scale bar, 50μm

4 过表达miR-200c降低单侧输尿管梗阻小鼠肾组织中TGF-β1、Smad3及α-SMA的上调

Western blot检测显示，与假UUO组比较，UUO组小鼠肾组织中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平较假UUO组明显升高，UUO+agomiR-200c组小鼠肾组织中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平明显低于UUO组（图6）。由此可见，过表达miR-200c能降低单侧输尿管梗阻性小鼠肾组织中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平的表达。

图6 过表达miR-200c对单侧输尿管梗阻小鼠肾组织中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平的影响。A，假UUO组；B，UUO组；C，UUO+agomiR-200c组Fig. 6 The effects of miR-200c upregulation on the levels of α-SMA,TGF-β1 and Smad3 in the renal tissues of mice with unilateral ureteral obstruction. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group

讨 论

肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展到终末期肾病的共同病理特征，表现为肾脏固有细胞缺失，肾单位结构破坏，成纤维细胞和肌成纤维细胞增生，生成大量细胞外基质堆积，导致肾脏功能丧失。肾间质纤维化是多种细胞因子和信号通路参与[14]，具体机制尚未完全清楚。本研究中我们建立UUO小鼠模型发现，小鼠梗阻侧肾脏较右肾明显增大，肾脏表面血管增粗，包膜紧张，颜色变浅，肾小管间质损伤病理评分下降，肾胶原容积分数（cVF）增加，肾组织中α-SMA蛋白表达水平增高，以上均提示UUO造模成功。

miRNAs是一类长约18～23nt的小分子非编码RNA，其可以通过与靶基因mRNA的3’UTR区特异性结合，在转录后水平对靶基因的表达进行调控，起着促进或者抑制肾脏纤维化的作用[15]。Sun等[16]学者发现miR-181c可以通过抑制EMT减轻环孢霉素A诱导的肾脏损伤和纤维化。Bijkerk等[17]报道沉默miR-132的表达能够通过抑制肌成纤维细胞的增殖减轻肾纤维化。Fang等[18]发现miR-382在UUO小鼠模型中表达减低，上调miR-382的表达可以通过抑制HSPD1的表达减轻肾脏纤维化进程。本研究中我们发现UUO组小鼠肾组织中miR-200c的表达明显降低，提示miR-200c可能与肾纤维化密切相关。

TGF-β1/Smad3信号通路是肾纤维化重要的调控通路。TGF-β1是一种促纤维化始动因子，通过TGF-β1/Smads信号通路参与机体器官纤维化的调控。TGF-β1能诱导成纤维细胞表达α-SMA而形成肌成纤维细胞，加速纤维化组织收缩，进而加重肾组织缺血缺氧，导致肾纤维化，研究已证实啮齿类动物中过表达TGF-β1可诱导肾纤维化反应[19]。肾纤维化动物模型中也已证实TGF-β1明显上调[20],使用TGF-β1中和抗体或使其受体的基因缺失能够明显减缓肾纤维化[21]。Smads是TGF-β家族信号的转导分子，其中Smad3是Smads家族重要成员之一，属于受体活化型Smad蛋白，是TGF-β1信号下游的第一个信号分子，被认为在TGF-β1信号通路上起着必不可少的核心作用[22]。TGF-β1与细胞受体结合后活化Smad3，通过核膜进入核内，通过直接与DNA结合实现促纤维化的作用[23]。miR-200c可以调控TGF-β1/Smad3信号通路，并且TGF-β1可以反过来调控miR-200c，TGF-β1可以通过诱导Smad3与位于miR-200c启动子序列上的Smad结合位点结合，从而抑制miR-200c表达[8]。本研究中我们发现UUO组小鼠肾组织中TGF-β1和Smad3的表达明显增高，而给予agomiR-200c干预的UUO小鼠肾组织中miR-200c表达明显升高，TGF-β1和Smad3的表达明显下降，并且血清Scr、BUN水平明显降低，肾小管间质损伤评分明显下降，肾胶原容积分数减少，肾组织中α-SMA蛋白表达也明显降低，提示miR-200c可以通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路活性，减轻UUO小鼠肾纤维化，从而改善肾功能。

综上所述，本研究证实miR-200c在肾纤维化小鼠肾组织中表达明显减低，上调miR-200c能够通过抑制TGF-β1/Smad3通路减轻UU0小鼠肾间质纤维化进程，可能成为肾纤维化治疗的潜在靶点。