三种转染试剂对RSC96细胞miRNA转染效率及细胞毒性影响的比较

刘玉璞，国海东，邵水金

（上海中医药大学基础医学院人体解剖教研室，上海201203）

施万细胞（Schwann cell，SC）是一种存在于周围神经系统中的神经胶质细胞，参与形成髓鞘，并对周围神经起到保护、促进轴突再生及再生轴突的髓鞘化等作用[1]。SC分泌多种神经营养因子和神经生长因子，参与周围神经损伤后的修复，因此被广泛研究[2]。

细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞以研究导入基因功能和机制的方法[2,3]。目前转染细胞常用方法主要为非病毒载体法和病毒载体法，前者操作简单，广为应用；后者则有安全性欠佳和步骤繁琐等缺点[4]。非病毒载体法所使用的转染试剂主要是脂质体，其中常用的脂质体Lipofectamine 2000对许多细胞都具有较好的转染效率[5,6]。

转染试剂对细胞的转染效率可能存在差异，如Lipofectamine 2000转染库普弗细胞则效率欠佳[7]。SC的转染效率较低，鲜见能够高效转染SC的转染试剂，这给科研人员造成了较大的障碍[8]。因此，本实验培养大鼠SC株（RSC96），利用几种常见的广泛应用的转染试剂转染绿色荧光标记物FAM，比较以找到效率最高的转染试剂，并对其进行细胞毒性的观察，以寻找到最理想的转染试剂。

材料与方法

1 实验材料

大鼠RSC96购自上海中科院细胞研究所，lipofectamine 2000购自invitrogen公司，FuGENE6 Transfection Reagent购自Promega公司，SuperFectin II reagent购自上海普飞生物技术有限公司，羧基荧光素（FAM）标记的microRNA（miRNA）阴性对照由上海吉玛制药技术有限公司合成，高糖DMEM培养基、胎牛血清（FBS）和PBS均购自美国CORNINIG公司，CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，TUNEL凋亡试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。

2 大鼠SC株RSC96的培养

大鼠RSC96是一种贴壁生长的细胞，所用培养液成分为含4.5g/L葡萄糖的DMEM（含10% FBS），置于37℃，5%CO2的培养箱中，2～3d传代1次。

3 三种转染试剂转染FAM标记的miRNA

3.1 Lipofectamine 2000转染

细胞按每孔100μl传代至96孔板，至少设5个复孔。待细胞长满培养瓶底的60%～70%行转染。换为不含血清的DMEM后分别将羧基荧光素（FAM）标记的miRNA阴性对照用Lipofectamine 2000转染RSC96，用法用量严格按照Lipofectamine 2000产品说明书，设置3个时间点：①转染24h后PBS清洗，换为正常培养液后于荧光显微镜下观察拍照，并计算转染效率，简称24h组；②转染48h后如上所述，拍照计数，简称48h组；③转染8h后清洗换液，48h后拍照计数，简称8h-48h组。

3.2 FuGENE 6 Transfection Reagent转染

转染试剂改为FuGENE6 Transfection Reagent，其他操作同上。

3.3 SuperFectin II reagent转染

转染试剂改为SuperFectinII Reagent，其他操作同上。

3.4 正常对照

将细胞正常传代到96孔板，不做转染，其他操作同上。

4 转染效率计算

按1∶100比例拍摄，用ImageJ对绿色荧光转染成功数和同视野下所有细胞数进行统计。3组各统计10个视野。该转染试剂转染效率（%）=绿色荧光细胞数/总细胞数×100%。

5 CCK-8法检测细胞活性

96孔板每孔加入10μl的CCK8试剂，放回细胞培养箱中静置2h后读取450nm波长处OD值（吸光度）。OD值越高表示细胞活性越高。

6 TUNEL染色检测细胞凋亡

96孔板每孔PBS清洗后4%多聚甲醛固定15min，按照TUNEL试剂盒说明加入适量TUNEL反应液后于37℃反应1h。PBS清洗，DAPI衬染细胞核，磷酸甘油封片，荧光显微镜下观察，拍照统计各组凋亡细胞占总细胞数的比例。

7 统计学分析

采用SPSS 22软件处理数据。所有数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SuperFectin II reagent转染效率高

应用FuGENE6 Transfection Reagent转染的细胞中未见任何被转染的细胞，与对照组相同，转染效率为0%；在用Lipofectamine 2000转染的细胞中可见较多的被转染细胞，其在3个时间点的转染效率分别为（38±8）%、（40±5）% 和（15±5）%，均低于60%；在用SuperFectin II Reagent转染的细胞中，可见更多被转染的细胞（图1），其在3个时间点的转染效率分别为（88±7）%、（90±6）%和（70±10）%，明显高于Lipofectamine 2000（P＜0.01）。由此表明，FuGENE6 Transfection Reagent不适于RSC96的miRNA转染；Lipofectamine 2000虽有一定的转染率，但不足以满足实验需求；只有SuperFectin II Reagent的转染效率能满足实验需求。此外，Lipofectamine 2000和SuperFectin II Reagent在8h-48h组的转染效率明显低于48h组，但SuperFectin II Reagent转染效率仍达到平均70%（图1），表明其在转染8h后换液其转染效率仍能基本满足实验需求。

2 三种转染试剂对细胞活力的影响

CCK-8检测细胞活性表明，在3个不同时间点，与Control组比较，FuGENE6 Transfection Reagent对细胞活力的影响无统计学差异，Lipofectamine 2000和SuperFectin II Reagent则不同程度地降低细胞活力；与Lipofectamine 2000组比较，SuperFectin II Reagent组细胞活力更低，表明SuperFectin II Reagent细胞毒性更大（图2）。此外，与48h细胞活力对比，8h-48h时Lipofectamine 2000和SuperFectin II Reagent组的细胞活力升高，表明转染8h后换液能够降低这两种转染试剂的细胞毒性。

图1 三种转染试剂转染FAM标记的miRNA（绿色荧光）效率对比。FuGENE 6，FuGENE 6 Transfection Reagen；Lipofectamin，Lipofectamin 2000；SuperFectin，SuperFectin II Reagent；比例尺，100μmFig. 1 Comparison of the transfection efficiency of FAM-labeled miRNAs (green) with three transfection reagents. FuGENE 6∶ FuGENE 6 Transfection Reagen; Lipofectamin∶ Lipofectamin 2000; SuperFectin∶ SuperFectin II Reagent; scale bar, 100μm

图2 CCK-8法检测3种转染试剂对细胞活力影响的统计学分析。**，P＜0.01，与Control组比较；##，P＜0.01，与Lipofectamin组比较Fig. 2 Statistical analysis of the effects of three transfection reagents on the cell viability by CCK-8 assay. **, P＜0.01, compared with control group; ##, P＜0.01, compared with Lipofectamin group

3 三种转染试剂对细胞凋亡的影响

TUNEL凋亡染色检测显示，在3个时间点，与Control组比较，FuGENE6 Transfection Reagent对细胞凋亡无明显影响；24h时，Lipofectamine 2000对细胞凋亡也无明显影响，48h和8h-48h时的Lipofectamine 2000能明显促进细胞凋亡， SuperFectin II reagent在3个时间均促进细胞凋亡，并明显强于Lipofectamine 2000（图3、4）。此外与48h时间点对比，8h-48h时SuperFectin II reagent组细胞凋亡减少，提示转染8h后换液能够降低SuperFectin II reagent的促细胞凋亡作用。

图4 TUNEL染色检测3种转染试剂对细胞凋亡影响的统计学分析。*，0.01＜P＜0.05，与 Control组比较；**，P＜0.01，与 Control组比较；##，P＜0.01，与Lipofectamin组比较Fig.4 Statistical analysis of the effects of three transfection reagents on apoptosis by TUNEL staining. *, 0.01＜P＜0.05 compared with control group; **, P＜0.01, compared with control group; ##, P＜0.01, compared with Lipofectamin group

讨 论

SC是周围神经系统中主要的神经胶质细胞，其参与神经的生长、损伤后修复，因此其作为周围神经系统损伤后修复的关键被广泛研究[9]，糖尿病患者周围神经病变，SC凋亡和脱髓鞘的机制研究已成热点[10]。细胞转染是医学科研工作中最常用的实验技术之一，SC属于难以转染的贴壁细胞，找到一种转染SC效率较高的转染试剂具有较高的科研价值[11]。

图3 TUNEL染色检测转3种染试剂对细胞凋亡的影响。比例尺，100μmFig.3 Effects of three transfection reagents on cell apoptosis detected by TUNEL staining. Scale bar, 100μm

本实验设置3个观察时间点，使用3种不同的转染试剂转染绿色荧光素FAM标记的miRNA阴性对照，从细胞转染效率角度评价其转染效果。数据分析表明，SuperFectin II Reagent的转染效率最高，能够满足SC转染后研究的需要；Lipofectamine 2000转染效率低；FuGENE6 Transfection Reagent可能不适用于转染miRNA进入SC。因此，不同转染试剂对于SC的转染效率存在着较大差异；在正式转染有关产品之前，最好先做下荧光标记的转染以确定转染是否成功。

转染试剂的细胞毒性不容忽视，毒性过大则直接影响到细胞的存活和增殖、迁移、凋亡方面的实验结果。根据CCK-8和TUNEL染色结果，FuGENE6 Transfection Reagent基本无细胞毒性，Lipofectamine 2000具有一定毒性，SuperFectin II reagent毒性更大，而经换液后则有一定程度的改善，结合第一部分转染效率的结果，建议使用SuperFectin II reagent对RSC96进行miRNA转染，并在8h进行换液以降低其细胞毒性。

值得提出的是，miRNA的激动剂和拮抗剂经过特殊化学修饰后成为miRNAagomir和antagomir，其在动物体内外具有更高的稳定性和效果持续时间，且能克服体内细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞。在后续试验中我们尝试以Cy3（红色荧光）标记的miRNAagomir阴性对照转染RSC96，结果也较为理想。因此，直接使用miRNAagomir和antagomir也不失为一种提高转染效率的方法。

Lipofectamine 2000是应用广泛的转染试剂，属于脂质体转染试剂，有转染需要更换无血清培养液、本身参与细胞生理活动造成一定细胞毒性的缺点[12]。有鉴于此，较多的非脂质体转染试剂被大力研究开发，FuGENE 6 Transfection Reagent就是其中之一，其具有较低的细胞毒性，转染效率与Lipofectamine 2000相当[13]，且无需更换培养液，简化操作步骤。SuperFectin II Reagent是第三代阳离子聚合物型转染试剂，目前尚在不断开发，其具有更广的细胞适用范围和更快的转染速度；但从本文结果看尚需注意控制其细胞毒性。总之，本实验为大鼠SC的基因领域研究打下基础，为更方便、高效的探究RSC96细胞相关基因修饰后的功能和机制提供便利。