食管癌术后患者化疗后血清蛋白指纹图谱变化及其意义

万清廉

基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI- TOF MS)能够有效的发现和检验血清等体液中肿瘤标记物[1-3]，具有高通量，微上样量，适合大样本检测等特点。弱阳离子蛋白芯片(WCX磁珠)能够提纯血清蛋白。许多研究表明：低分子量蛋白片段，特别是分子量小于20 kD，能够提供新的诊断癌症和其他疾病的检验方法[4-6]。食管癌(esophageal cancer)是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一[7]，也是中国最高发的恶性肿瘤之一，高居中国恶性肿瘤死因中的第四位[7-8]。以手术为主的术前术后进行放化疗综合治疗，已成提高患者生存期的有效手段。化疗后患者血清蛋白是否有变化，意义如何，本研究旨在联合应用WCX磁珠和MALDI- TOF MS检查，及ClinProt 2.2软件和SNN方法建立食管癌手术后、化疗后患者诊断模型，比较其变化，探讨化疗对食管癌术后患者相关蛋白质表达谱的影响。

1 资料与方法

1.1 病例分组

患者均为2015年1月至2016年1月间郑州人民医院胸外科住院患者，均经术后病理检查确诊为食管鳞状细胞癌。化疗方案：多西他赛75mg/m2·d1，顺铂75mg/m2·d1，5-氟尿嘧啶750 mg/m2·d1～5，q21d。健康志愿者血清资料由中国人民解放军150中心医院检验中心实验室提供。详细临床资料见表1。所有患者都享有知情权并签字同意参与采血，且经过医院伦理委员会批准。各组患者均清晨空腹采静脉血5 ml，并于4 ℃冰箱静置30 min，然后3 000 r/min离心机离心10 min，取上层血清约1 ml植于J管内，样本保存于-80 ℃冰箱内备用。所有试验设计标本收集齐全后，液氮罐保存样本到中国人民解放军150中心医院检验中心实验室进行试验。

表1 食管癌术后、化疗后患者及健康对照组临床资料

注：实验组与对照组间年龄，性别比较，P>0.05。

1.2 试验仪器及方法

德国Brucker Daltonics公司提供WCX磁珠和AutoflexⅢ型质谱仪及标准血清peptide和protein混合物。试验中为去除血清中高丰度蛋白的影响，利用WCX磁珠进行血清蛋白提纯，方法同参考文献[6]。样品混匀后行质谱分析。用已知相对分子质量的标准品进行误差校正。样品随机点样于384抛光靶，每8个样品加一个标准血清控制实验流程质量。先点1 μl样品，室温干燥后，再点1 μl基质(3 mg/ml)CHCA，50%，CAN，2%TFA)，室温干燥后上机检测。质谱数据采用ClinProt线性阳离子模式，参数如下：第1离子源20 KV，第2离子源18197 KV，检测蛋白质范围0～20 000 Da。每份样品点4个靶点，对于不同结晶点，多点采集，每个点200shots，选10个不同位置累计2000shots。先用高能量激光轰击，再换成低能量激光采集图谱。

1.3 数据的处理与分析

采用ClinProt Model系统分析，其中数据包括Recognition Capability表示分组准确率，100%最好。Intergration Regions used for Classification：说明模型所用的质谱峰，Weight表示权重，值越大表示在模型中越重要；2D PEAK Distribution：红绿色表示两个组的数据分布，没有重叠表示模型质量好。Box D：选择的都是在分组准确率达到100%的某个建模方法所用到的质谱峰(分子量表示)，表示某组里某个分子量峰面积分布的箱体图，横坐标为分组，纵坐标为峰面积或强度，右上角注明相应的分子量。ROC D：选择的都是在分组准确率达到100%的某个建模方法所用到的质谱峰(分子量表示)，表示某组里某个分子量的检验效能(接收者工作曲线)，横坐标为特异性，纵坐标为灵敏度，文字表示信息包括峰的分子量，AUC表示曲线下面积，值越接近1，表示其检验效能越好。人工神经网络(SNN)算法运算建立实验组诊断模型，66例样本随机划分，80%作为训练组，20%作为盲法组，验证诊断模型的特异度和灵敏度。

1.4 统计学处理

应用SPSS16.0数据包t检验分析临床资料，P<0.05为差异有统计学意义。ClinProt 2.2软件包处理。

2 结果

2.1 术后组和健康对照组检测的蛋白质荷比峰情况

检测出术后组和健康对照组相对分子质量在0～20000范围内的所有蛋白质荷比峰，对每一个质荷比峰做成组数据比较，共检测出113个蛋白峰(P<0.01)，峰有49个。其中有8个上调峰和41个下调峰，应用ClinProt 2.2软件包，用过SNN运算，最终筛选出1个差异显著的蛋白质荷比峰(m/z 676.61)建立诊断模型。

2.2 术后化疗组和健康对照组检测的蛋白质荷比峰情况

检测出食管癌术后化疗组和健康对照组相对分子质量在0～20 000范围内的所有蛋白质荷比峰，对每一个质荷比峰做成组数据平均数比较，共检测出105个蛋白峰(P<0.01)，峰有58个。其中有8个上调峰和50个下调峰，利用ClinProt 2.2软件包，用过SNN运算，最终筛选出1个差异显著的蛋白质荷比峰(m/z 676.46)建立诊断模型。

2.3 术后化疗组和术后组蛋白质荷比峰情况

检测出食管癌术后组与食管癌术后化疗组血清蛋白相对分子质量在0～20 000范围内的所有蛋白质荷比峰，建立诊断模型，手术后化疗组蛋白质荷比峰(m/z 3951.77，2661.11，823.61，824.08，5907.51，6670.7，4266.81，810.47，4965.26，1519.3，849.63，1466.09，1617.58，1467.16，758.8)，分组正确率为100%。

3 讨论

以手术为主的术前术后进行放化疗综合治疗，已成提高患者生存期的有效手段。术后辅助化疗的机制是消除根治性手术后残留在食管癌患者体内的微小转移灶，预防其局部复发与远处转移。毛伟敏等[9]的Meta分析比较了手术并辅助化疗与单纯手术的疗效，文献结果表明，辅助化疗可延长患者的3年无进展生存(RR 1.225;95%CI 1.012～1.482;P=0.037)，但并未提高患者的3年、5年生存率。Emi等[10]研究表明，多西他赛/顺铂/氟尿嘧啶联合放疗，进行术前新辅助放化疗，耐受性好，治疗总有效率86%(完全缓解57%，部分缓解29%)，有更高的病理完全缓解率，值得临床进一步研究。该项研究结果与Eisterer等[11]进行的Ⅱ期临床研究结果相似，提示该方案进行新辅助治疗，是安全、可行、有效的。近5年来国内有多名作者利用MALDI-TOF MS方法来筛选不同肿瘤的肿瘤标记物，取得了一系列研究成果。诸如：贲门癌[12]，胃癌[13]，大肠癌[14-15]，肝癌[16]，非小细胞肺癌[17]等，食管癌[18-20]的相关诊断模型已有多篇，但鲜见有同期行手术后、化疗后诊断模型的建立，以及它们之间相互关系的研究。

本研究应用MALDI-TOF MS 的ClinProt和WC磁珠分选技术检测食管鳞癌手术后、化疗后患者和健康对照组血清标本，其目的是建立诊断模型。经过数据分析得出食管癌术后组(m/z676.61)、化疗后(m/z676.48)，上述断模型的特异度100%和灵敏度100%。刘会宁等[21]应用ELISA 分析出食管癌患者体内Reg Iet 蛋白表达水平明显升高，且随着食管癌的切除而下降，这表明某些异常的蛋白表达与食管癌明确相关。王立东等[22]的研究也提示这些异常表达的蛋白与肿瘤预后呈正相或负相关，并且其中一些蛋白可能参与了食管癌发生发展过程。术后化疗后组与术后组比(m/z 3951.77，2661.11，823.61，824.08，5907.51，6670.7，4266.81，810.47，4965.26，1519.3，849.63，1466.09，1617.58，1467.16，759.8)，分组正确率为100%。化疗对患者血清蛋白图谱有显著影响，说明化疗后使某些与肿瘤相关的蛋白上调(m/z 3951.77，6670.7，810.47，849.63，758.8)，以及下调(m/z 5907.51，2661.11，823.61，824.08，4266.81.4965.26，1519.3，1466.09，1617.58，1467.16)，这一观点与周峰等[23]观点相同，放化疗治疗后使某些与肿瘤相关的蛋白质表达下调，将至正常人的水平，在图谱上显示其峰强度与正常对照组基本相当。化疗导致了血清蛋白变化，其发生机制不清楚，有待于进一步研究。经过筛选所得到的蛋白质峰能作为食管癌术后以及化疗后标志物，其灵敏度和特异度高，对预后判断分析具有一定临床意义。