子宫内膜癌患者NF-κb信号通路相关蛋白的表达与疾病严重程度的关系分析

马诗影

子宫内膜癌是临床上较为常见的妇科肿瘤疾病，其发病率高居第三，仅次于卵巢癌和宫颈癌，每年死于子宫内膜癌的人数呈逐年上升趋势，子宫内膜癌近年来成为了国内外研究者的研究热点。子宫内膜癌的发病机制信号通路研究，对于研究疾病发病机理，疾病药物治疗新靶点等方面具有非常重要的意义。NF-κB家族蛋白是近年来研究较多的核转录因子，有报道表明[1-4]，NF-κB信号通路在胃癌、肺癌等恶性肿瘤中表达上调，且与上述肿瘤患者疾病发展、侵入和转移密切相关。目前NF-κB信号通路在子宫内膜癌中研究报道较少，本研究将选择2014年1月至2017年1月于我院就诊的120例子宫内膜癌患者作为研究对象，探讨NF-κB家族蛋白P65，P50及IκBα蛋白表达水平与子宫内膜癌疾病严重程度的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选择2014年1月至2017年1月于我院就诊的120例子宫内膜癌患者作为研究对象，纳入标准：①均经病理学检查确诊为子宫内膜癌；②患者均未进行放疗、化疗等治疗。排除标准：①合并心理疾病、精神疾病患者；②合并慢性感染性疾病、心肺功能障碍、恶性肿瘤者或者其他重大疾病患者。根据FIGO病理分期进行分组如下：Ⅰ期组(30例)、Ⅱ期组(32例)、Ⅲ期组(30例)和Ⅳ期组(28例)。同时选择我院同期健康体检者30例作为对照组。Ⅰ期组(30例)，男性14例，女性16例；年龄19～53(41.8±3.5)岁。Ⅱ期组(32例)，男性16例，女性16例；年龄19～52(41.8±3.3)岁。Ⅲ期组(30例)，男性14例，女性16例；年龄20～53(41.8±3.5)岁。Ⅳ期组(28例)，男性14例，女性14例；年龄19～55(42.8±3.5)岁。对照组(40例)，男性15例，女性15例；年龄19～55(43.8±3.5)岁。各组患者在性别、年龄等一般资料比较无明显差别，差异无统计学意义(P<0.05)，资料具有可比性。本研究获得医院伦理委员会批准，所有患者自愿签署知情同意书。

1.2 实验材料

NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα抗体购自abcam公司；Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒均购自坦克拉公司；TGL-16G-A型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；7300型实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；基础电泳仪(美国Bio-Rad公司)；酶标仪(Thermo公司)；EL204-电子天平(上海特勒-托多利多仪器有限公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；免疫组化检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 RT-PCR检测NF-κB信号通路相关基因表达水平[5]

根据Trizol试剂盒提取组织总RNA，采用核酸测定仪测定RNA纯度和浓度，取1 μg进行逆转录，生成cDNA。采用SYBR green染料法进行定量检测，NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα扩增引物序列为如表1，扩增条件及计算方法参考文献[6]。

表1 RT-PCR反应引物设计

1.4 Western blot检测NF-κb信号通路相关蛋白的表达水平[7]

常规方法提取组织总蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)方法测定蛋白质含量后，进行凝胶电泳，每孔上样20 μg，电转至聚偏氟乙烯薄膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上后，3%的脱脂奶封闭2 h，分别孵育NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα(目的蛋白)和GAPDH(内参蛋白)一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，孵育二抗后显影。采用Quantityone软件对条带亮度进行分析。

1.5 免疫组化[8]

采用常规方法制备5 μm厚的石蜡切片，进行免疫组化染色，在10 mmol/l柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)的热激30 min介导抗原复性，采用抗NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα单克隆抗体孵育，4 ℃过夜。洗涤后孵育二抗，加显色液后进行曝光。根据染色强度(0～3分，0分为无染色，1分为弱染色，2分为中度染色，3分为强染色)进行判分。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 RT-PCR检测NF-κB信号通路相关基因表达

与对照组相比，子宫内膜癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα mRNA表达水平均升高，且mRNA表达水平随着子宫内膜癌疾病严重程度的增加而升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 RT-PCR检测NF-κB信号通路相关基因相对表达水平

注：与对照组相比，*为P<0.05。

2.2 Western blot法检测各组中NF-κB信号通路相关蛋白表达

与对照组相比，子宫内膜癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα 蛋白表达水平均升高，且蛋白表达水平随着子宫内膜癌疾病严重程度的增加而升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，具体见表3和图1。

表3 Western blot法检测各组中NF-κB信号通路相关蛋白表达水平

注：与对照组相比，* 为P<0.05。

1为对照组，2为Ⅳ期组，3为Ⅲ期组，4为Ⅱ期组，5为Ⅰ期组。

2.3 免疫组化法检测各组中NF-κB信号通路相关蛋白的阳性表达率

免疫组化结果表明，与对照组相比，子宫内膜癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα阳性率均升高，且阳性率随着子宫内膜癌疾病严重程度的增加而增高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，具体见表4。

表4 各组中NF-κB信号通路相关蛋白的阳性表达率(例，%)

注：与对照组相比，*为P<0.05。

3 讨论

子宫内膜癌是临床上最常见的妇科肿瘤之一，其具有较高的发病率和死亡率，每年死于子宫内膜癌的人数呈逐年上升趋势，子宫内膜癌近年来成为了国内外研究者的研究热点。子宫内膜癌的发病机制信号通路研究，对于研究疾病发病机理，疾病药物治疗新靶点等方面具有非常重要的意义。NF-κB家族蛋白是近年来研究较多的核转录因子，NF-κB家族蛋白可能与肿瘤细胞的增殖、凋亡等息息相关。NF-κB是1类核转录因子，在非刺激状态的时候，NF-κB与它的抑制物IκBα结合，此时NF-κB是以1种未被激活的形式，并且存在于胞质中。当细胞受到损伤等条件的刺激后，与NF-κB结合的IκBα发生降解，NF-κB释放并且被激活，最终转移至胞核中参与调控各类相关蛋白的转录，故NF-κB参与相关靶基因的转录，调控细胞增殖、凋亡等过程[9-11]。NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα蛋白是常见的NF-κB家族蛋白成员。关于NF-κB家族蛋白与子宫内膜癌的关系，国内外研究较少。Lin等[12]研究表明，NF-κB家族蛋白与子宫内膜癌密切相关，抑制NF-κB的表达，可以改善子宫内膜癌疾病。Mori等[13]研究结果表明，子宫内膜癌患者易高表达NF-κB，子宫内膜癌的疾病严重程度和不良预后与NF-kB水平高表达息息相关。

本研究中，RT-PCR和Western blot结果表明，与对照组相比，子宫内膜癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα mRNA和蛋白表达水平均升高，且mRNA和蛋白表达水平随着子宫内膜癌疾病严重程度的增加而增加。免疫组化结果表明，与对照组相比，子宫内膜癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα 表达阳性率均升高，且表达阳性率随着子宫内膜癌的疾病严重程度的增加而增加。

综上所述，NF-κB信号通路相关蛋白NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα在子宫内膜癌的发生、发展中具有重要作用，并且上述蛋白表达水平与子宫内膜癌的疾病严重程度呈正相关，可作为判断子宫内膜癌的疾病严重程度和预后的指标，研究NF-κB信号通路与子宫内膜癌的关系，对于研究疾病发病机理，疾病药物治疗新靶点等方面具有非常重要的意义。