杜仲总多糖EOP高调肺癌LLC细胞中caspase3表达来抑制肿瘤细胞增殖的机制研究

李 晖 骆志国

肺癌是目前发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤，其中以非小细胞肺癌为多见，约占肺癌所有病例的80%～85%。由于肺癌具有很强的侵袭迁移能力，所以是恶性肿瘤较高的肿瘤之一，且具有多种多样的生物学特性[1-2]。现有大量的研究证实Caspase3是一切凋亡信号传导的共同通路，前期查阅大量文献未见有杜仲通过激活caspase3途径来诱导肿瘤细胞凋亡的相关报道[3-4]。此外，虽然有证据表明在非小细胞癌中Caspase3可通过切断PARP途径，裂解DNA引起细胞凋亡，对抗Surivin基因抑制凋亡作用从而诱导肿瘤细胞凋亡[5-7]，但国内外关于EPO通过激活caspase3途径抑制肺癌细胞侵袭的研究亦未见报道。本研究中一是研究杜仲总多糖(EOP)对Lewis肺癌小鼠LLC细胞体外生长的抑制作用：检测EOP、CDDP对LLC及KMB-17的细胞毒作用，证明其能否抑制肺癌细胞生长。二是探讨杜仲总多糖(EOP)抑制Lewis肺癌小鼠LLC细胞的可能作用机制：检测EOP、CDDP作用LLC细胞前后细胞中Caspase3 mRNA表达水平和蛋白表达水平的变化，证明其是否通过激活Caspase3 途径诱导肺癌细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1 细胞株试剂与仪器

1.1.1 细胞株 小鼠Lewis肺腺癌LLC细胞株和人胚肺组织KMB-17二倍体细胞株购于西安交通大学。

1.1.2 主要试剂 caspase3 抗体(兔抗人多克隆抗体，NEB 原装)，pYSTAT3 抗体(兔抗人多克隆抗体，PharMigen 原装)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RPMI-1640培养基(Gibco公司，货号：22400-071)，PBS(江苏恒瑞)。

1.1.3 主要实验仪器 流式细胞仪(美国BD公司)；CO2培养箱、漩涡振荡仪(美国Thermo公司)；高速低温离心机(德国Ependoff公司)；倒置光学显微镜(奥林巴斯)；酶标仪(北京伯辉生物科技有限公司)；电泳仪、电转移仪、垂直电泳槽(杭州汇尔仪器设备有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将冻存的LLC细胞和KMB-17细胞从-150 ℃冰箱取出，37 ℃水浴锅中快速融解后，用75%酒精消毒，在超净工作台中移至干净的15 ml离心管中，补充9 ml新鲜的1640培养基。3 000 r/min，离心10 min。弃掉培养基，加入5 ml新鲜的1640+10%FBS悬浮沉淀，转移至细胞培养瓶中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。细胞培养基变黄后，换液，继续培养。

1.2.2 四甲基偶氮唑蓝(MTT) 比色法测定EOP和CDDP抑制LLC、KMB-17细胞生长的最佳作用浓度 选择细胞状态良好的LLC和KMB-17细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μl，铺板使待测细胞调密度至1×104/孔。96孔板置于5%CO2，37 ℃孵育48 h，分别加入200 μl含有0.5 μg/ml，1.0 μg/ml，2.0 μg/ml，4.0 μg/ml，8.0 μg/ml EOP和CDDP继续培养48 h。48 h后用每孔加入180 μl无血清培养基和20 μl MTT溶液，继续培养4 h，4 h后弃掉上清培养液，每孔中加入150 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。选择EOP和CDDP刺激LLC细胞和KMB-17细胞的的最佳作用浓度。

1.2.3 细胞划痕法观察EOP及CDDP对LLC细胞迁移的影响 ①先用Maker笔在六孔板背后，用直尺比着，均匀的划出横线，大约每隔0.5～1 cm一道，横穿过孔。②在孔中加入5×105个细胞。③次日用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。④用PBS洗细胞3次，洗掉划下的细胞，加入新鲜的无血清培养基培养。⑤置于37 ℃5%CO2的培养箱中培养，24 h拍照，观察细胞迁移情况。

1.2.4 Realtime PCR法检测caspase3 mRNA表达 Trizol法提取细胞总RNA，Nanodrop 2000微量核酸分析仪检测RNA的纯度及浓度。用5 μg RNA样品进行逆转录，根据测定的RNA浓度，计算5 μg反转录所需RNA的量，加入0.2 mLEP管中；加入Oligo dT(18)1 μL；补加无RNA酶水至11 μL，轻弹管壁混匀，瞬离；PCR仪上65 ℃变性5 min后迅速置于冰上，使之冷却，防止二级结构的产生；然后加8 μL 的MIX，体系如下：Transcript Reversase 1 μL，Transcript Reversase Inhibitor 1 μL，5×reaction Buffer 4 μL，10 mM dNTP 2 μL，总体积为20 μL，轻弹管壁混匀，瞬时离心将液体甩至管底，设置PCR仪孵育42 ℃反应60 min，70 ℃ 5 min终止反应，-20 ℃保存待用。Real time PCR加样体系如下：2×SYBR Green 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 5 μg，补无菌双蒸水至20 μL。加完样后上荧光定量PCR仪反应。反应程序如下：94 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)40个循环，72 ℃10 min。

1.2.5 Western blotting法检测caspase3蛋白表达 按照100 μL 细胞裂解液RIPA加1 μL蛋白酶抑制剂PMSF来提取脑肿瘤细胞总蛋白，采用BCA法检测胞总蛋白浓度。取30 μg蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，100 V恒压电泳2 h，待目的条带分离开后300 mhA横流转膜1 h，将凝胶中蛋白质转移至固相载体PVDF膜上。PVDF膜在TBST中洗5 min以洗掉膜上的transbuffer，然后在含5%脱脂奶粉的TBST中以800 rpm/min，室温封闭2 h，孵育一抗，小鼠抗人caspase3抗体稀释比例为1∶1 000，鼠抗β-actin抗体稀释比例为1∶1 000，稀释液为5%BSA，放入湿盒中在4 ℃冰箱孵育过夜。次日，TBST洗膜4次，每次15 min。山羊抗小鼠IgG二抗1∶5 000，室温孵育2 h，用化学发光凝胶成像系统进行ECL化学发光显色。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MTT比色法测定EOP及CDDP抑制LLC、KMB-17细胞生长的最佳作用浓度

分别将含有0.5 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、4.0 μg/ml、8.0 μg/ml EOP和CDDP培养基200 μL加入单层LLC和CDDP细胞培养，MTT法检测EOP及CDDP抑制LLC、KMB-17细胞生长的最佳作用浓度，结果显示：实验组中，与对照组相比，2.0 μg/ml，4.0 μg/ml，和8.0 μg/ml EOP均可不同程度的抑制LLC细胞核KMB-17细胞的生长，其中4.0 μg/ml的EOP可明显抑制LLC和KMB-17细胞的增殖，具有显著性差异(P<0.01)。同样，阳性对照组也有相同的结果，与对照组相比，2.0 μg/ml，4.0 μg/ml，和8.0 μg/ml CDDP均可不同程度的抑制LLC细胞核KMB-17细胞的生长，其中4.0 μg/ml的CDDP可明显抑制LLC和KMB-17细胞的增殖，具有显著性差异(P<0.01)。因此4.0 μg/ml 作为后续实验EOP和GDPP的最佳刺激时间，具体结果见图1。

2.2 细胞划痕法观察EOP及CDDP对LLC细胞迁移的影响

4 μg/ml EOP和4 μg/ml CDDP分别作用于小鼠Lewis肺腺癌LLC细胞株48 h，结果显示，与对照组相比，4 μg/ml EOP和4 μg/ml CDDP均可显著抑制LLC细胞的增殖迁移，划痕部分覆盖率下降，肿瘤细胞侵袭程度明显降低，说明EOP可抑制肺腺癌LLC肿瘤细胞的迁移，具有显著的抑癌效果。见图2。

2.3 Western blot法检测caspase-3蛋白水平的表达

采用RIPA法提取正常对照组、EOP作用组和CDDP作用组的LCC细胞总蛋白，BCA定量法进行DNA定量，取30 μg蛋白变性后经SDS-PAGE凝胶电泳检测3种细胞中caspase3蛋白水平的表达。结果显示：EOP组和CDDP组caspase3的mRNA与对照组相比，显著增加，P<0.01，具体结果见图3。

2.4 RT-PCR法检测caspase-3mRNA水平的表达

TRIZOL法提取正常对照组和EOP作用组，CDDP作用组的LLC细胞总RNA，反转录为cDNA，实时荧光定量RCR检测3种细胞中caspase3 mRNA水平的表达。结果显示：EOP组和CDDP组caspase3 mRNA的表达水平与对照组比较，显著增高，P<0.01，具体结果见图4。

图1 MTT法检测不同浓度EOP和CDDP对LLC和KMB-17细胞的抑制作用

图2 细胞划痕法

图3 Western blot法检测caspase-3蛋白表达水平

图4 RT-PCR法

3 讨论

肺癌是近年来严重威胁人类生命和健康的恶性肿瘤，它的发病率居重症疾病首位，也是死亡率极高的恶性肿瘤。近50年来肺癌的发病率和死亡率明显增高，发达国家更为明显，我国肺癌发病也呈增长趋势，近20年来每年肺癌新发病例以大约0.5%的速度增长，死亡率增加了近1.5倍，是增长最快的恶性肿瘤。

恶性肿瘤在化疗上的风险在于一旦治疗方案失败，将产生多药耐药，患者生存期将减少，生活质量下降。然而杜仲在抗肿瘤作用的具体作用机制目前尚不清楚。现有的研究仅表明，EOP具有清除氧自由基，提高机体的抗氧化能力，减轻细胞损伤，减少过氧化产物丙二醛(MDA)的产生、增强超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的作用。其具体机制尚有待深入研究[8-9]。

细胞凋亡过程的紊乱与肿瘤的发生发展密切相关。凋亡的调控基因很重要的家族是Caspase3超家族[10]。Caspase3在许多恶性肿瘤中高表达，抑制肿瘤细胞凋亡，研究Caspase3的表达情况对肿瘤的治疗和预后有重要意义[11-12]。

本研究中发现：EOP和CDDP抑制LLC细胞和KMB-17细胞增殖的最佳作用浓度为4.0 μg/ml，最佳作用时间为48 h。细胞划痕实验结果显示，EOP和CDDP均可显著抑制肿瘤细胞LLC的侵袭迁移，划痕细胞覆盖率降低。RT-PCR和western blot 结果显示，EOP组的caspase3的mRNA水平和蛋白水平的表达均显著高于对照组。与王强等[6]的发现一致，caspase3在肺癌组织中表达升高，杜仲总多糖EOP可抑制肺癌细胞LLC的增殖，并且是通过诱导caspase3途径活化，促进细胞凋亡，从而抑制肿瘤的继续扩增，为杜仲总多糖在临床的应用提供了扎实的理论研究基础。