人乳腺癌组织中Wnt2基因的表达及靶向抑制基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭力的影响

崔 雄 韩龙海

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，近年来发病率呈升高趋势，且逐渐年轻化，严重威胁我国女性生命安全[1-2]。研究表明，Wnt信号通路也在肝癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤中表现出一定的促癌作用[3-4]。Wnt2是Wnt信号转导通路中的1个信号转导因子，且近年研究表明，Wnt2基因与肿瘤的发生、侵袭转移及患者预后密切相关，但对乳腺癌的相关研究报道较少，因此其与乳腺癌之间的关系也越来越受到重视[5]。本研究即探讨Wnt2基因在乳腺癌组织中的表达情况及靶向抑制Wnt2基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭力的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2015年3月至2016年10月本院收治的68例乳腺癌患者作为研究对象，按全国乳腺癌病理协作组制定的诊断标准进行病理组织活检确诊，所有患者手术之前均未接受放化疗及内分泌等抗肿瘤药物治疗。所有患者平均年龄(46.57±2.15)岁；平均病程(7.52±2.53)年。病理分型：导管内癌45例，单纯癌18例，乳头状癌3例，大汗腺癌2例；TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ42例，Ⅲ期6例。收集患者癌组织、癌旁组织(距癌组织2 cm以上)和正常组织，生理盐水冲洗后用液氮进行迅速冷冻后超低温冰箱保存。另选取女性健康志愿者60例，平均年龄(47.23±2.32)岁。2组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，组间具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会研究批准且所有纳入患者及家属均知情同意。

1.2 材料

1.2.1 细胞株 人乳腺癌细胞株MCF-7，购自中科院上海细胞库。

1.2.2 主要试剂及仪器 人Wnt2 ELISA检测试剂盒(武汉华联科生物技术有限公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT，Sigma公司)；DMEM培养基，胎牛血清(FBS，GIBCO公司)；胰蛋白酶(Bio SHARP公司)；Transwell小室(Millipore公司)；SP试剂盒(北京中山生物技术有限公司)；兔抗人Wnt2多克隆抗体(武汉中美科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 Wnt2表达量的测定 采集2组研究对象术前空腹静脉血5 mL，离心取上清，分装后置于-80 ℃冰箱中保存待检；采用EILSA法检测患者血清中Wnt2表达量。

取适量癌组织、癌旁组织和正常组织，用免疫组化法(IHC)测定组织中Wnt2阳性表达情况：将保存的乳腺癌组织、癌旁组织和正常组织进行石蜡包埋，制作石蜡切片，切片厚约4 μm，采用经多聚赖氨酸包被的载玻片进行贴片，于60 ℃电热保温干燥箱内干燥24 h。将切片浸于二甲苯中脱蜡，然后经梯度酒精水化，3% H2O2封闭10 min，PBS洗涤；滴加一抗：用1∶100稀释的兔抗人Wnt2多克隆抗体工作液孵育，放置于4 ℃冰箱过夜；次日弃去一抗，滴加二抗(HRP标记的通用型IgG)，于37 ℃恒温箱放置20 min；PBS洗涤后，加DAB工作液避光显色3～5 min，苏木精复染5 min，脱水至透明，中性树胶封片。在显微镜下观察颜色程度，染色强度评分标准：无颜色为0分、浅黄色为1分、深黄色为2分、棕褐色为3分；每张切片随机选择5个高倍镜视野(×400)观察阳性细胞率，阳性细胞率≤10%为0分、>10%～25%为1分、>25%～50%为2分、>50%～75%为3分、>75%为4分；染色强度评分×阳性细胞评分作为IHC评分，0～4分为Wnt2低表达，5～12分为Wnt2高表达。

1.3.2 细胞培养及转染方法 乳腺癌细胞株MCF-7用DMEM培养基，于37 ℃含5% CO2培养箱中培养，并接种于12孔培养板中进行转染。利用转染试剂Lipofectamine 2 000将Wnt2的siRNA和阴性对照(NC)的siRNA分别转染到MCF-7细胞中，分别称为Wnt2-siRNA组和NC-siRNA组，培养24 h后进行相关指标的测定。

1.3.3 CCK-8法测定2组细胞的增殖能力 取2组细胞以5 000个/孔接种于96孔板，每组设3个重复，同时设空白对照孔，分别培养24 h、48 h、72 h和96 h后弃去培养基，加入不含FBS的不完全培养基，再加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h后，用酶标仪测定OD450 nm值。

1.3.4 流式细胞仪测定2组细胞的凋亡率 分别取2组对数生长期的细胞，4×105个/孔接种于6孔板，2 mL/孔，每组设3个重复，培养24 h后1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞2次后，用1×Binding buffer洗1次，收集细胞，再加入100 μL 1×Binding buffer重悬，接着加入5 μL AnnexinV-APC室温避光孵育15 min后，加入1 mL 1×Binding buffer，1 000 r/min离心5 min弃上清，再加200 μL 1×Binding buffer重悬，接着加入5 μL 7-AAD混匀，1 h内用流式细胞仪检测。

1.3.5 Transwell实验测定2组细胞迁移及侵袭能力 Transwell细胞迁移实验：取2组细胞进行常规洗涤、消化，每组做3个重复，1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用无FBS培养基调整细胞密度为1×106个/mL，取150 μL接种于Transwell小室的上室，含10% FBS的培养基600 μL接种于下室，培养12 h后，用棉签擦去上室内的细胞，95%甲醇固定20 min，PBS洗涤3遍后，结晶紫染色30 min，于倒置相差显微镜下观察细胞迁移情况，拍照并记数。Transwell细胞侵袭实验：Transwell小室外膜均匀涂抹50 μL纤维粘连蛋白，风干后，再于内膜涂抹30 μL Matrigel稀释液，37 ℃过夜凝胶。取2组细胞进行常规洗涤、消化，1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用无FBS培养基调整细胞密度为1.5×106个/mL，其他步骤同上。于倒置相差显微镜下观察细胞侵袭情况，拍照并记数。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 2组血清中Wnt2含量比较

68例乳腺癌患者和60例健康志愿者血清Wnt2的含量分别为(10.56±3.62)ng/mL、(1.89±0.86)ng/mL，2组间差异具有统计学意义(t=18.049，P<0.01)。

2.2 不同组织中Wnt2的表达情况

乳腺癌组织中Wnt2阳性细胞率、染色强度、IHC评分均高于癌旁组织和正常组织，组间差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同组织中Wnt2表达情况

2.3 2组细胞增殖能力比较

2组细胞在培养24 h至96 h时的OD450 nm值逐渐升高，但Wnt2-siRNA组细胞在培养24 h、48 h、72 h、96 h的OD450 nm值均显著低于NC-siRNA组，组间差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见表2。

表2 2组细胞增殖能力比较

2.4 2组细胞凋亡率比较

Wnt2-siRNA组细胞凋亡率为(8.56±0.52)%，显著高于NC-siRNA组的(6.18±0.63)%，差异具有统计学意义(t=22.568，P<0.01)。

2.5 2组细胞迁移和侵袭能力比较

迁移能力比较：Wnt2-siRNA组细胞穿过Transwell小室的细胞数为(85.00±2.00)个，显著少于NC-siRNA组的(142.00±4.00)个，差异具有统计学意义(t=98.727,P<0.01)。侵袭能力比较：Wnt2-siRNA组细胞穿过Transwell小室的细胞数为(57.00±4.00)个，显著少于NC-siRNA组的(89.00±4.00)个，差异具有统计学意义(t=43.818,P<0.01)。

3 讨论

乳腺癌是我国女性高发恶性肿瘤，且发病率逐年提升，临床上多采用手术、放疗等进行治疗，但会引起多种并发症，影响患者生存质量，乳腺癌致病机理尚未有统一结论，临床上缺乏治疗该病的靶向手段。近年来，越来越多的研究表明血管新生、癌细胞增殖及侵袭力与乳腺癌的发生发展有关[5]。

Wnts为相对分子质量约40 000的分泌型糖蛋白，广泛表达于各种组织中，通过与细胞表面、细胞外基质的广泛联系发挥作用进而对胚胎早期发育进行调控，而当细胞内外界因素发生变化时会造成Wnts过度活化，进而发生失调导致机体发育异常或形成肿瘤[6-7]。Wnt2是Wnt信号通路中的重要分子，Wnt信号通路在肝癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤中已有研究，且均显示其具有一定的促进癌细胞增殖、生长及转移的作用。然而，Wnt2在相关肿瘤以及乳腺肿瘤中的作用研究报道相对较少。研究表明[8-9]，Wnt2能通过多种分泌途径诱导乳腺上皮细胞形态发生改变；食管癌肿瘤纤维母细胞可大量分泌Wnt2，进而通过激活Wnt2-β连环蛋白信号通路，最终促进食管癌细胞生长。郭变琴等[10]研究表明，乳腺癌组织中Wnt2 mRNA的转录水平显著高于配对癌旁乳腺组织。本研究首先对68例乳腺癌患者及健康志愿者进行血清学检测Wnt2含量，结果显示68例乳腺癌患者和60例健康志愿者血清Wnt2含量差异具有统计学意义；另外IHC研究结果显示，乳腺癌组织中的Wnt2阳性细胞率、染色强度、IHC评分均高于癌旁组织和正常组织，部分揭示Wnt2基因的高表达与乳腺癌的发生有关。

临床研究[11]显示Wnt2的过表达与恶性肿瘤的侵袭潜能、肿瘤分期、临床分级呈正相关。肿瘤的转移是造成患者恶性程度升高的关键原因，肿瘤细胞侵袭及转移是1种复杂、连续的多步骤过程，肿瘤细胞具有从原发部位脱离并在迁移到转移部位进行增殖的能力，不仅与细胞自身改变相关，也与肿瘤细胞及宿主微环境间的相互作用密切相关。在胶质瘤细胞等肿瘤模型中，靶向干扰Wnt2表达后抑制了肿瘤生长、血管生成、转移，说明Wnt2参与肿瘤的发展[12]。徐卫燕等[13]研究发现，乳腺癌组织中Wnt2阳性表达率明显高于癌旁组织和正常组织，Wnt2高表达的乳腺癌细胞的侵袭能力和黏附率均高于Wnt2低表达的乳腺癌细胞。由此可见，Wnt2参与肿瘤细胞迁移和侵袭，因此Wnt2或可成为靶向治疗乳腺癌的新目标。本研究中采用CCK-8法测定细胞的增殖能力，流式细胞仪测定细胞的凋亡率，并进行Transwell小室侵袭/迁移实验，采用与天然基底膜极为相似的基质胶铺在Transwell小室膜上，有效地在体外模拟肿瘤细胞的侵袭过程。结果显示，Wnt2-siRNA组细胞在培养24 h、48 h、72 h、96 h的OD450 nm值均显著低于NC-siRNA组，组间差异显著。Wnt2-siRNA组细胞凋亡率为(8.56±0.52)%，显著高于NC-siRNA组的(6.18±0.63)%。Wnt2-siRNA组细胞穿过Transwell小室的细胞数显著少于NC-siRNA组。提示靶向抑制Wnt2基因表达能有效地降低MCF-7乳腺肿瘤细胞侵袭和迁移的能力。

综上所述，乳腺癌组织中Wnt2的表达显著增加，靶向抑制Wnt2基因后能够降低乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，增加其凋亡能力，部分揭示Wnt2与乳腺癌的发生发展有关，为乳腺癌的治疗提供靶向目标。