化学与生物法制备抗坏血酸棕榈酸酯及其食品应用研究进展

张润润 石玉刚 黄欣莹 潘 莹 曾鲁瑶 孙锦程 Rammile Ettelaie

(浙江省现代食品安全与营养协同创新中心；浙江工商大学食品与生物工程学院食品工程系1, 杭州 310035)(利兹大学食品科学与营养学院2，英国利兹 LS29JT)

L-抗坏血酸棕榈酸酯(L-ascorbyl palmitate)，简称L-AP (图1)，是一种重要的抗坏血酸衍生物，脂溶性抗氧化剂，不仅拥有抗坏血酸的抗氧化及防止血管硬化、治疗败血症的药理作用，因其分子中的疏水烷基长链，增加了其脂溶性，拓宽了它在食品中的应用范围，是一种高效，营养，绿色的食品添加剂[1-2]。

图1 L-AP的分子结构式

目前，常用的抗氧化剂主要有：叔丁基对苯二酚 (TBHQ)、二丁基羟基甲苯 (BHT)、丁基羟基茴香醚 (BHA)、没食子酸丙酸 (PG)、茶多酚等[3-4]。1980年，“辅致癌作用和肿瘤促进剂的生物效应”国际讨论会对BHA, BHT和TBHQ评价认为：虽没有发现基因毒性和致癌性，但它们是潜在肿瘤促进剂[2]。在日本、欧洲和美国已禁止BHA、BHT和TBHQ在婴幼儿和儿童食品中使用，提倡用L-AP和生育酚等。它是天然成分抗坏血酸与棕榈酸酯化后的AA衍生物，对人体无毒害作用，且耐高温，是我国《食品添加剂使用卫生标准》唯一许可的可用于婴幼儿食品中的抗氧化剂[2]。由于其自身的功能特性及广泛的应用前景，吸引了众多学者们开展了有关制备及应用研究。

1 化学法制备L-抗坏血酸棕榈酸酯

1.1 直接酯化法

该方法主要是将抗坏血酸与棕榈酸在无机强酸如浓硫酸[5-9]、无水氢氟酸[10]的催化下制得粗品 (图2a)，再经精制后而得成品 (表1)。抗坏血酸在热浓硫酸中的稳定性较差，为提高产品质量，酯化反应需控制在较低的温度下进行。此外，抗坏血酸参与反应的方式、催化剂的用量以及棕榈酸与抗坏血酸的摩尔比也是影响反应的重要因素。

Paul等[5]报道称98%～99%的浓硫酸作为催化剂和反应介质，将过量的脂肪酸溶解于浓硫酸中，克服了传统工艺中抗坏血酸过量带来的高成本不足，且脂肪酸的回收复用更容易实现。抗坏血酸与棕榈酸的摩尔比为1∶1.36时，20～25 ℃下反应4～16 h，产物产率高达85%。但若采用发烟硫酸，产率反而下降，这或许表明酯化反应的程度与溶剂的含水量有密切关联。Gruetsmacher等[10]以无水氟化氢作为催化剂和溶剂，副反应比较少，又避免了过量原料的回收；但无水氟化氢的价格较高，且对设备的抗腐蚀性能要求更高。上述强酸性环境中通过直接酯化合成L-AP的方法，反应时间长(20～40 h)。曹会兰等[7]将0.03 mol 抗坏血酸溶于98%浓硫酸中，24 h后再加入棕榈酸，30 ℃，反应2～3 h，该方法不仅收率较高(86%)，且反应速度加快。Wen等[8]将超声技术应用于L-AP的合成，反应时间缩短至2 h。

图2 制备L-AP的常见化学方法

表1 化学法制备L-抗坏血酸棕榈酸酯

反应物(nAA:nPA)反应类型催化剂溶剂温度/℃反应时间/h转化率/%参考文献1∶1.2～1∶1.36酯化98% H2SO498% H2SO420～304-1885～865-63∶4酯化98% H2SO498% H2SO4302-38671∶:1-1.5∶1酯化、超声98% H2SO498% H2SO424～50290～9381∶0.75～1.1∶1酯交换95%,99% H2SO495% H2SO420～251673～7510-111∶1.07酰卤无DMA/DCM01872.512n(AA):n(SOCl2):n(PA)=1.2∶1.3∶1.0酰卤无DCM25690.2913

直接酯化法目前仍然以浓硫酸为催化剂和反应溶剂，存在环境污染重、反应设备要求高、易发生副反应、产品分离提纯困难等诸多缺点。

1.2 酯交换法

酯交换法由两部分组成，中间体棕榈酸酯的合成以及产物L-AP的合成 (图2b)。棕榈酸酯产率越高，杂质越少，L-AP的后续纯化过程越方便，产物纯度亦越高。虽然酯交换法反应路线较直接酯化法长，但提纯操作较容易。张卫等[10]、龚大春等[11]以棕榈酸与甲醇酯化制取棕榈酸甲酯，然后将其加入到溶有抗坏血酸的浓硫酸中，转酯化制备L-AP。由于棕榈酸甲酯在浓硫酸中的溶解度较大，加快了反应速度，节省了酸用量；且反应过程中无水生成，避免了催化剂浓度变化，反应时间缩短至18 h，总产率为73%。

1.3 酰卤法

棕榈酰氯法合成工艺由两部分组成，棕榈酰氯的制备和抗坏血酸的酯化 (图2c)。陆豫等[12]先用棕榈酸与二氯亚砜反应制备棕榈酰氯，然后棕榈酰氯在二甲基乙酰胺 (DMAC)和二氯甲烷溶剂中，在通氯化氢气体，0 ℃下与抗坏血酸反应18 h，产率84.3%。该法避免了浓硫酸的使用，且反应温度低，副产物少，反应纯度高，粗产品颜色洁白[4, 10]。该法适用于空间位阻较大或活性较差脂肪酸的酯化反应。

2 生物法制备抗L-抗坏血酸棕榈酸酯

化学法不可避免地存在反应条件苛刻，需要特殊的反应器，产物分离及提纯步骤繁杂等缺点；且化学合成产品仍存在潜在的食品安全隐患。酶催化法主要是利用脂肪酶作为生物催化剂，催化抗坏血酸与棕榈酸酯化。酶催化法具有以下优点：1) 反应条件温和，不需高温高压；2) 催化反应特异性高，不易产生副产物；3) 产物品质高，环境污染小；4) 产品后处理简便、有机溶剂消耗低、生物催化剂易于重复利用等优势。并且该技术可满足消费者们对天然健康抗氧化剂的需求，已经成为众多科研工作者的研究重点领域之一，反应过程如图3所示[14-17]。

图3 脂肪酶催化合成抗L-AP

表2 生物法制备L-抗坏血酸棕榈酸酯

生物酶反应物(VC:palmitic acid)非水溶剂体系反应温度/℃反应时间/h转化率/%参考文献Powdered lipases from porcine pancreas (PPL), Rhizomucor miehei (RML), Pseudomonas cepacia (PCL), and C. rugose (CRL)1∶2.5hexane37625～5819Bacillus stearothermophilus SB 1 lipase (12.7U/mg)1∶2.5hexane6069719surfactant-coated lipase (from Burkholderia cepacia)1∶6tert- butanol50244720Novozym 435 (from Candida antarctica lipase B)1∶9tert-butanol,Ultrasound 132 W80327.1514Novozym 4351∶9tert-butanol70176715Novozym 435, Lipozyme TL IM, Aspergillus niger lipase, Rhi-zopus chinensis lipase1∶11tert-pentanol/DMSO solventsystem (9∶1, v/v)501864.7416Immobilized Lipase(from Pseudomonas stutzeri)1∶5tert butanol55505717Lipolase 100L1∶2.5DMSO751820 mg/mLYield21Novozym4351∶5tert-amyl alcohol7017122

2.1 酶的种类及固定化酶

目前生物法制备L-AP所用酶源，主要集中在脂肪酶。其中Novozym 435，Lipozym TL IM和Lipozyme RM IM 是目前有关L-AP的理论及实际生产应用研究过程中使用较多的商品化固定脂肪酶(表2)。如Lerin等[14-15]考察了不同溶剂中Novozym 435和Lipozyme RM IM催化酯化的反应情况，抗坏血酸与棕榈酸摩尔比为1∶9，Novozym 435浓度为5 wt%，叔丁醇作为反应介质，70 ℃，17 h，最高反应转化率为67%。Jiang等[16]结合统计实验设计(Plackett-burman design，Steepest ascent design和Central composite design)与溶剂工程技术优化了Novozym 435和Lipozyme TL IM在叔戊醇与DMSO混合溶剂体系中催化反应，最适反应条件下产物浓度接近20.63 g/L，这也是目前已报道的最高时空产率(3.35 g/L/h)。Santibáez等[17]考察了Novozym 435在70 ℃条件下催化抗坏血酸与棕榈酸(摩尔比1∶10)的酯化反应情况。

近年来，研究者逐渐关注L-AP的连续化生产的研究，如Zhao等[18]设计了一种固定床生物反应器 (packed-bed reactor，PBR)，反应器内置了两根填充柱，一根填充了分子筛，用于除去反应过程中副产物水，另一根填充了Novozym 435，作为催化反应场所，实现连续化生物法制备LABEs。

此外，为了克服传统商品化脂肪酶在实际应用中催化效率低的不足，人们还尝试其他脂肪酶，如固定在疏水性聚丙烯载体Accurel EP 100上的脂肪酶BacillusstearothermophilusSB 1 lipase[19]。利用非离子表面活性剂丙二醇单硬脂酸酯包衣脂肪酶Burkholderiacepacia制备得表面活性剂包衣酶 (图4)[20]。Santibáez等[18]将Lipase TL固定在疏水性载体上octyl-agarose (TLOA)，反应的转化率为57%。Sharma等[21]利用Celite 545 matrix载体固定化脂肪酶Lipolase 100 L，以DMSO为溶剂，75 ℃反应18 h，显著提高了反应产率至80%。

图4 非离子表面活性剂丙二醇单硬脂酸酯包衣脂肪酶

2.2 反应介质

许多绿色化学概念里认为无溶剂才能排除溶剂的负面影响，无溶剂体系虽然比较简单又安全，但往往需要至少一个反应底物是液体。而当底物和催化剂都是固体，催化剂则很难与底物发生有效相互作用。因此，溶剂具有许多不可替代的作用。非水介质中酶催化反应的溶剂主要为有机溶剂、离子液体、超临界流体等。其中有机溶剂是酶催化合成抗坏血酸脂肪酸酯最常用的反应媒介。Bradoo等[20]选用乙腈等有机溶剂作为反应的介质，50 ℃反应6 h后。结果表明，在正己烷 (logP=3.5)中反应转化率最高。脂肪酶在具有较高logP值的溶剂中往往可保持催化活性[23]。然而，若酶促反应底物分子结构中含有多个羟基基团时，如L-抗坏血酸，将增大体系的logP值，导致脂肪酶在有机溶剂中的溶解度下降。为了克服上述困难，通过选择一类共溶剂混合体系作为反应介质[16]。所以，有机溶剂的选取必须同时满足两个条件：保持脂肪酶的高活性；有效地增加抗坏血酸的溶解度。

离子液体也是一种近年来发展研究较多的高效生物催化反应介质，尤其是新型功能离子液体的合成与应用研究[24]。许多酶都尝试用于离子液体中进行催化，如脂肪酶、蛋白酶和氧化还原酶等[25]。其自身具体的独特物化性质包括不挥发，出色的热稳定性，成为极好的替代传统挥发性溶剂的选择。近年来，人们以期利用离子液体作为反应溶剂，改善该酶促反应的催化效果。如Adamczak等[26]选用6种离子液体作为反应介质，用Candidaantarcticalipase B催化油酸和抗坏血酸反应生成抗坏血酸油酸酯，实验发现，在以[BMIM][BF4]离子液体为介质时，反应物的转化率最高达到72%。本课题组已有研究结果表明，我们课题组长期从事功能离子液体的合成与应用研究[24-28]，通过在咪唑环结构的阳离子上接枝不同链长的醚链结构，变换阴离子的种类，以期筛选出能有效促进酶促反应的新型功能性离子液体EILs (图5)[24-25,27-29]。这类离子液体中的特殊结构，一方面能被用作酶促反应强化剂，特异性提高聚合物酶链式反应的选择性[29]；另一方面，能提高如蔗糖及酚酸等极性有机分子的溶解度，大大提高此类酶促反应的产物得率[23]。

图5 醚型离子液体

2.3 外加场辅助手段

微波合成已在化学合成领域应用十分广泛。微波加速有机反应主要用微波的热效应和非热效应来解释。微波的热效应表现在其高效加热特性使反应速率加快。微波的非热效应表现在微波起到类似催化剂的作用，调节反应动力学，降低了反应活化能，提高反应速率。自1990年以来，微波被应用于生物催化领域特别是在非水相酶催化方面逐渐增多，可以被称作微波辐射-酶耦合催化(Microwave Irradiation-Enzyme Coupling Catalysis, MIECC)。MIECC不仅可以提高酶催化活性，加快酶催化反应速度，还可以提高或改变酶催化反应的立体选择性，提高反应的平衡产率。如Gedye等[30]发现在微波中进行的一氰基酚盐与苯甲基氯的反应要比传统加热回流要快240倍。Costa等[22]利用Novozym 435催化反应，研究了在微波环境下对生成抗坏血酸棕榈酸的影响。70 ℃反应1 h生成的抗坏血酸棕榈酸的转化率可高达71%。

此外，适宜强度的超声波可以加速产酶细胞的新陈代谢过程，提高胞内酶的产率，并使酶的构象正向转化，提高酶的活性和底物的转化率。同时，超声波还能促进酶与底物分子之间的相互作用，改善传质效率；增加介质中质点的振动能量，升高介质温度，提高反应速率。如Lindomar[14-15]利用Plackett-Burman design方法，对超声波辅助下酶促反应的主要因素进行了优化， 132 W超声震荡，70 ℃，仅3 h，反应转化率最高为27.15%[14]。

3 抗坏血酸棕榈酸酯在食品中的应用

3.1 抗坏血酸棕榈酸酯在油脂中的抗氧化作用

在食品的储藏与加工过程中发生的油脂氧化往往会导致食品产品质量下降，营养成分流失，货架期缩短等不利影响。油脂受自然环境因素影响发生氧化，会伴随异味，变色和其他形式的变质现象[31]。L-AP是一种有效的油脂氧化自由基阻断剂[32]，亦可用作α-生育酚的协同作用增效剂 (synergist) (图6)。猪油及各种植物油的抗氧化过程中，硫辛酸与二氢硫辛酸与L-AP组合使用效果更佳[33]。香菜植物萃取物(1600 mg/kg)与L-AP (500 mg/kg)组合物能有效抑制葵花子油在180 ℃热处理30 h过程中的氧化进程[34]。Serfert等[35]报道称使用一种δ构型衍生物含量高的抗氧剂生育酚，L-AP和卵磷脂的三元复合抗氧剂组合，能有效提高富含长链多不饱和脂肪酸鱼油的氧化稳定性。α-生育酚、β-胡萝卜素与L-AP三元复合物对黄油三酰基甘油酯的氧化抑制效果优于其中的二元混合抗氧剂组合[31]。L-AP结合血红素铁和酪蛋白钙的共喷雾干燥(co-spray-drying)技术，有效抑制了贮藏期内棕榈油的氧化[36]。

图6 L-AP作为自由基阻断剂

油脂在高温煎炸过程中容易发生氧化、聚合、分解和水解反应，导致油脂酸价、过氧化值、羰基价等指标升高，并产生对人体有害的物质。含有抗坏血酸酯的复合煎炸油稳定剂较其他抗氧化剂具有更强的耐高温性能，延缓油脂劣变速度。其机理主要通过载体的乳化、包埋，使抗氧化剂在高温、水解等条件下不易被损耗，并在煎炸过程缓慢释放，有效抑制高温油脂的氧化酸败。

3.2 抗坏血酸棕榈酸酯在乳制品中的抗氧化作用

婴幼儿配方乳粉中一般添加多不饱和脂肪酸(如DHA、EPA、AA)进行调配脂肪的比例，多不饱和脂肪酸很容易被氧化，在微量金属如Cu2+和Fe3+的催化作用，容易产生不良气味的醛类物质。若保存期间奶粉发生以上变化，蛋白质、维生素和氨基酸等将受到分解破坏，营养价值降低。其中乳粉中维生素C是最容易被破坏的一类物质，有氧的存在，它迅速被氧化成脱氢抗坏血酸盐[37]；同时核黄素光化学破坏后产生的光色素和光黄素可大大加速维生素C的氧化破坏过程。0.05 g/kgL-AP较其他天然抗氧化剂(甾醇、卵磷脂、AA)具有更好的抗氧化功效，能使乳制品的货架期延长1～2 倍。添加α-生育酚和L-AP可有效减少牛乳因氧化而产生的戊醛与庚醇气味，但并未对己醛与庚醛的气味起到抑制效果[38]。抗氧剂的效能往往受到其自身极性与溶解度的影响，而这又直接影响抗氧剂在O/W乳液体系中的实际作用位点。著名的“极性相悖论”(polar paradox theory)指出：极性较强的抗氧剂在非极性体系中的抗氧化能力较强，而非极性抗氧剂在极性体系(如O/W乳液体)中抗氧力较强[39]。Let等[40]研究发现脂溶性L-AP不仅可完全抑制富含鱼油的牛奶乳液的氧化，且能有效避免因使用抗氧化剂生育酚而导致的助氧化副作用 (prooxidant effect)。Zou等[41]考察了α-生育酚,β-胡萝卜素,L-AP, AA, 柠檬酸, 它们的复配物，对婴幼儿配方奶粉乳液的氧化稳定性影响。α-生育酚与β-胡萝卜素的抗氧化效果存在协同效应。

3.3 抗坏血酸棕榈酸酯在高油脂及其他食品中的应用

L-AP在油脂中有更大的溶解度，具有更能让人在感官上接受的气味。Issa等[42]研究了L-AP对精制棉籽油(CO)、原生橄榄油 (VOO) 化学的相互酯化(chemical interesterification (CI))的氧化稳定性影响，该实验以脂肪酸组成、PV值(peroxide value)和MAD含量(malonaldehyde contents)作为考察指标，对在60 ℃贮藏28 d后的CO与VOO进行评价，结果表明，加入L-AP的油脂PV值显著降低。Anna等[43]在富含鱼油的能量棒中添加3种不同的抗氧剂 (咖啡酸、L-AP与γ-生育酚)，抑制油脂氧化的效果较佳。

L-AP可以作为面制品改良剂和抗氧化剂。添加了0.38%的L-AP，可缩短面团发酵的时间，增强面包内部蓬松程度和柔软性，增加面包营养性[35]。另外，L-AP还能抑制面包霉变，延长面包的货架期。L-AP具有良好的热稳定性，将其加入面包中，能够促使面包中铁离子的吸收。当面包中的L-AP与Fe的摩尔比为4∶1时，Fe的吸收率分别达20.2%[44]。添加L-AP与血红素铁和酪蛋白钙的共喷雾干燥技术(co-spray-drying)对血红素铁强化的烘焙食品(巧克力夹心饼干)的氧化稳定性有显著提升作用，产品的货架期可延长至1 年[45]。将L-AP加入卤肉制品中，具有一定的抗菌作用，提高了卤肉制品的食用安全性[46]。

3.4 在保健食品的应用

血液中过氧化脂质的升高，比胆固醇的升高对动脉粥样硬化的形成危害更大。由于L-AP独特的脂溶性，在保健食品方面主要用作人体抗氧化剂和营养强化剂。L-AP还能阻止亚硝胺的产生，可预防癌症，对于预防心脑血管病和抗衰老有较好的效果，是一种很好的营养强化剂。Kageyama等[47]研究发现，L-AP能强烈地抑制Ehrlich ascites癌细胞的DNA合成，分解癌细胞细胞膜的磷脂，是良好的抗癌物质。Janesirisakule等[48]通过在姜黄素分子结构上嫁接聚乙烯醇链而制备出一种新的纳米载体[CUR-PV(OH)]，该载体表现出良好的自由基清除效果，利用该纳米载体对L-AP进行微胶囊化，更有利于L-AP通过毛囊通道渗透入猪皮的真皮层内部。

4 结束与展望

随着人们对于生活健康品质的追求日趋重视，对食品中的抗氧化剂要求越来越高，这就需要更高质量的抗氧化剂来满足人们的需求，这也就对制备方法及生产工艺提出更大的挑战，以期实现目标产品的纯度更高，产量更高。这些都激励研究者们努力进一步探寻更有效的制备方法(化学或生物转化等)，摸索更优化的生产工艺条件(工艺参数、过程模拟等)，生产出更多更好的抗坏血酸棕榈酸酯产品。