驴源性DNA检测试剂盒的研制与评价

陈思秀，刘玟妍，高秋月，张馨方，艾金霞，孙丽媛

（北华大学医学技术学院，吉林吉林132013）

驴肉具有高蛋白、低脂肪、必需氨基酸丰富等特点，驴肉中矿物元素铁含量高于其他畜禽肉[1]，而且驴肉中生物价值较高的亚油酸、亚麻酸含量远远高于猪肉、牛肉[2]。驴肉营养丰富、味道鲜美、食用价值高，随着生活水平的提高，人们对驴肉的需求也越来越高。由于驴的饲养周期长，存栏量少，致使驴肉价格上涨。一些不法商家或个人为了追求自身利益用马、骡、牛、羊甚至猪、鸡、鸭肉来冒充驴肉[3]，掺假问题突出，严重损害了消费者利益。如2014年沃尔玛超市掺有狐狸肉的“驴肉”[4]、欧洲的“马肉风波”。驴肉市场的混乱迫切需要一种科学且简单、快速的方法对驴肉及驴肉制品进行鉴定，加强对市售驴肉及驴肉制品的检测鉴别。

驴肉的真伪鉴别可依据感官鉴定法[5]、蛋白质分析法[6]、ELISA法、分子生物学鉴定。其中，传统的感官鉴定法主要依据对肉类的感官和形态检验为主，主观因素影响较大，且无法对已加工的肉制品进行鉴别；蛋白质分析法无法对已深加工、蛋白质变性的肉类进行检测；ELISA法虽然费用较低，且简单、方便，但容易出现假阳性、假阴性结果。聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）法是常用的分子生物学鉴定方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，但PCR法对实验环境和操作人员要求较高，影响因素较多，不适于在基层开展。为使该技术在基层大范围开展并普及，本科研团队研发了驴源性DNA检测试剂盒，可成功鉴别驴肉真伪。

1 材料与方法

1.1 实验样品 驴肉、牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉等常见生肉样由长春食品药品检测中心提供及本地超市购买。

1.2 实验试剂 2×Taq PCR MasterMix、洗脱缓冲液TE、100 bp DNA Ladder、λDNA HindIII、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、pGM-T连接试剂盒、pGM-T感受态细胞均购自北京天根生化科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 实验仪器 ZF型紫外透射反射分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；H-2050R低温高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；ETC811 PCR基因扩增仪（苏州东胜兴业科学仪器有限公司）；DYY-8B型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）；GeneAmp*PCR System 9700 PCR仪（美国Per-kin-Elmer公司）；HH.S精密恒温水浴锅（江苏金坛市医疗仪器厂）；D1008E手掌型离心机；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）。

1.4 驴源性DNA检测

1.4.1 驴肉及其他常见肉类DNA提取 取肉样剪碎约称取0.05 g，置离心管中。加入P1（Tris-HCl、EDTA、NaCl、10%SDS、PK 酶和 ddH2O）溶液 500 μL，P2（10%SDS）溶液 30 μL，P3（PK 酶）溶液 15 μL混匀，置于56℃水浴振荡1 h。取出加入P4（饱和乙酸钠）溶液500 μL，充分混匀10 min，10 000 r/min离心10 min。取上清液加入等体积P5（异丙醇）溶液，-20℃放置1 h。取出后10 000 r/min离心10 min。弃去上清液，沉淀中加入70%冰冻乙醇溶液500 μL，混匀，11 000 r/min离心10 min（重复1次）。弃去上清液，沉淀室温晾干后，分别加入P6（ddH2O）溶液100 μL溶解DNA，混匀，作为供试品DNA溶液。

1.4.2 DNA浓度、纯度检测 将提取的基因组DNA经适当稀释，用紫外分光光度计测量260 nm和280 nm处的吸光度A260和A280，每个样品测定3次，取平均值。以A260/A280鉴定DNA的浓度及纯度。

1.4.3 PCR引物 在GenBank中下载驴种属基因序列（GenBank：JF718884.1）、牛种属基因序列（GenBank：HQ184045.1）、羊种属基因序列（GenBank：HM236 185.1）、猪种属基因序列（GenBank：GU135833.1）、鸡种属基因序列（GenBank：GU261717.1）和鸭种属基因序列（GenBank：KX534428.1），应用NCBI Primer-BLAST在线引物设计软件设计驴、牛、羊、猪、鸡和鸭种属特异性引物（表1），由深圳华大基因科技服务有限公司合成。

表1 特异性引物序列

1.4.4 PCR扩增反应 优化PCR反应体系和反应参数，确定最适PCR反应体系： 2×Taq PCR Master Mix 10 μL，引物 F、R（10 ng/μL）各 0.5 μL，DNA 模板（100 ng/μL）0.5 μL，无菌ddH2O将体积补足至20 μL于PCR反应管中，放入PCR仪。最适PCR反应参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.4.5 PCR产物检测 取4 μL PCR产物点样于1.5%琼脂糖凝胶上，85 V/cm电泳85 min，停止电泳。将凝胶置于紫外分析仪中观察，照相。正品驴、牛、羊、猪、鸡、鸭肉应在447、256、317、214、398、512 bp处有单一明亮条带。

1.4.6 种属特异性基因片段克隆 紫外灯下切下驴肉及其他常见肉类特异性DNA片段，进行凝胶回收；测定其DNA浓度，转化大肠杆菌后涂板过夜培养；蓝白筛选后转入LB液体培养基于37℃恒温气浴振荡器中培养过夜；质粒小提，测定其DNA浓度。选取浓度超过100 ng/μL的样本交由生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。分析测序结果，并将提取的质粒经PCR鉴定后稀释一定浓度作为试剂盒的阳性对照。

1.5 驴源性DNA检测试剂盒组装 试剂盒为20次用量，包括DNA提取体系和PCR扩增体系。DNA提取体系（表2）：P1、P2、P3是细胞消化液；P4、P5是 DNA 沉淀剂；P6是DNA溶解液。PCR扩增体系：2×Taq PCR Master Mix 混合酶、引物、无菌双蒸水、阳性对照（克隆后的驴牛羊猪鸡鸭产物）、阴性对照（无菌双蒸水）。

表2 驴肉DNA检测试剂盒组成

1.6 驴源性DNA检测试剂盒的评价

1.6.1 特异性检测 操作者和实验员在不知晓待检样品真伪的情况下使用试剂盒法对随机编号的1个正品和5个伪品进行盲检，标准品作为阳性对照。

1.6.2 灵敏度检测 随机挑选1个驴肉正品，测量其DNA浓度。依次进行10倍梯度稀释，直到10-6ng/μL，每个稀释度各取1 μL作为模板进行PCR扩增，于1.5%琼脂糖凝胶上，85 V/cm凝胶电泳85 min，将凝胶置于紫外分析仪上拍照。

1.6.3 稳定性检测 随机挑选1个试剂盒，由-20℃取出，室温下溶解，再置于-20℃冷冻，如此反复冻融5、10、20次后，对试剂盒内的DNA提取试剂，阴、阳性对照样品进行检测。

1.6.4 有效期检测 将试剂盒于-20℃保存，于制备后的当日及每间隔1个月检测驴肉正品、易混品及阴性对照各1次。

2 结 果

2.1 驴肉等基因组DNA的提取 将所提取的基因组DNA在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，如图1所示，各泳道均出现明显条带，说明驴肉等基因组DNA提取成功。

图1 驴肉等基因组DNA提取电泳结果

2.2 驴肉及常见肉类DNA的浓度与纯度 经重复测定，本试剂盒法提取的样品DNA纯度均在1.80～2.10（表3），每个样本3次测量数值差异小于0.01，说明试剂盒法提取的DNA纯度高，无蛋白质污染。

2.3 引物特异性试验结果 如图2所示，驴、牛、羊、猪、鸡、鸭种属特异性引物分别在447、256、317、398、214、512 bp处出现特异性条带。

2.4 克隆结果及比对结果 克隆后所提DNA经TM 58℃ PCR扩增后于1.5%琼脂糖凝胶电泳，克隆结果与预期目的条带位置一致，分别在447、256、317、398、214、512 bp出现明显条带（图3）。扩增的目的片段经测序后，在NCBI上BLAST比对后，结果表明该片段的核苷酸序列与GenBank中已登记的驴、牛、羊、猪、鸡、鸭相似性均为100%，证明克隆的DNA片段即为目的基因片段。

表3 驴肉及常见肉类DNA浓度和纯度检测结果

图2 引物特异性试验结果

图3 重组构建的质粒PCR琼脂糖凝胶电泳图谱

2.5 驴源性DNA检测试剂盒评价

2.5.1 特异性检测 对随机编号的样品进行盲检，正品出现明显条带，伪品均未出现条带，见图4。

2.5.2 灵敏度检测 如图5所示，稀释到10-3ng/μL时，在447 bp处出现浅带，小于该浓度则未出现条带。说明该试剂盒的最低检测灵敏度为10-3ng/μL。

2.5.3 稳定性检测 试剂盒分别冻融5、10、20次后仍能提取驴肉DNA并扩增出447 bp目标条带，表明试剂盒有良好的稳定性。

图4 特异性试验结果

图5 驴源性DNA检测试剂盒灵敏度检测结果

2.5.4 有效期检测 将试剂盒于-20℃保存1年，12个月中每次检测结果均一致，说明本试剂盒在-20℃保存条件下，检测结果准确可靠，至少可保存1年。

3 讨 论

驴肉营养价值较高，分子生物学方法鉴定驴肉真伪越来越受到重视，常用的分子生物学检测方法为 PCR法。PCR 法灵敏度高，影响因素较多，比如在配制PCR反应体系时，由于操作者手法不稳致使溶液混合不匀；PCR反应体系配置时容易发生漏加或少加现象，易造成假阴性结果；DNA提取过程中标本的交叉污染可造成假阳性或假阴性结果，因此PCR法的基层普及度不高。

在DNA提取方面，所用试剂较少，且标志清晰不易造成混乱，根据试剂盒要求，提取肉样DNA时所需样本量极微，仅需0.05 g肉样就可提取出目的DNA，步骤简便，试剂无毒，安全环保。在PCR检测方面，本科研团队根据GenBank种属特异性Cytb靶基因设计特异性引物[7-10]，通过一系列优化实验，最终确定LV等引物在TM为58℃、引物模板量为0.5 μL时最佳，特异性强。选取驴肉等常见肉类特异性条带进行克隆，经测序在NCBI上BLAST比对后相似性均为100%，测浓度后稀释到10 ng/μL作为阳性对照。本试剂盒提前将除DNA模板外的PCR反应体系全部加至Eppendorf管中，操作者只需在配好的PCR反应体系中加入待检的DNA提取液即可进行下一步骤，以防操作者漏加或多加，最大程度减少PCR加样过程中的操作误差。本试剂盒检测驴肉正品、市售驴肉及伪品，正品均在447 bp处出现明显条带，伪品未出现条带，简单方便。灵敏度试验表明本试剂盒的最低检测限为10-3ng/μL。本试剂盒于-20℃条件下反复冻存最少20次，具有良好的稳定性，可于-20℃条件下保存1年。

4 小 结

本试剂盒法提取肉类及肉制品DNA、PCR反应、琼脂糖凝胶电泳等一些列试验，可在6 h内完成，在1次实验中能鉴别出待检驴肉中是否为驴源性成分，是否掺有牛、羊、猪、鸡、鸭源性成分。相较荧光PCR法鉴定肉类及肉制品，该试剂盒价格便宜，无需购买荧光PCR荧光探针、特定仪器等，减轻经济负担；该法操作简单方便，可大大减少质检工作人员的工作量。试剂盒法准确度高、特异性好、灵敏度强、稳定性高，可广泛应用到驴肉的质量监督工作中。