卵巢癌移植瘤裸鼠靶向CEUS参数与基质金属蛋白酶2的相关性

李 茜，曾倩倩，刘 慧，向 红

(新疆医科大学第一附属医院妇产超声科，新疆 乌鲁木齐 830054)

卵巢肿瘤早期诊断困难，患者预后差。基质金属蛋白酶-2(metalloproteinase-2, MMP-2)在人卵巢癌血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)结构中有特异性表达[1-2]，且其过表达与卵巢肿瘤的发生、发展有关[3]。目前关于靶向CEUS与MMP-2相关性的研究较少。本研究通过靶向CEUS检测不同时期卵巢癌时间强度曲线(time intensity curve, TIC)参数，以免疫组化方法检测MMP-2强度，探讨靶向CEUS参数与MMP-2的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 BALB/cNude雌性裸鼠50只，6～8周龄，体质量18～22 g(北京维通利华生物科技有限公司)。人卵巢SKVO3癌细胞株SKVO3(北京北纳创联生物技术研究院)，超声造影剂SonoVue(Bracco公司)，生物素化大鼠抗小鼠MMP-2单克隆抗体MMP-2[艾博抗(上海)贸易有限公司]，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记山羊抗大鼠IgG抗体(Ebioscience公司)，链霉亲和素、生物素化脂质(Sigma公司)，鼠抗人CD31单克隆抗体一抗，鼠抗人MMP-2单克隆抗体(Invitrogen公司)，山羊抗鼠生物素标记二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，山羊抗兔IgG抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，DAB显色液(北京中衫金桥生物技术有限公司)，PAS染色液(南京建成科技有限公司)。

1.2 建立模型 参考文献[4]的方法建立裸鼠卵巢癌移植瘤模型。将人卵巢SKOV3细胞经胰蛋白酶消化后以无血清1640培养液洗涤，并于37℃、5%CO2、完全饱和湿度的培养箱中进行常规培养，调整活细胞浓度为5×107个/ml，待卵巢癌SKOV3细胞株处于对数生长期且传代培养至7～8代时提取细胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，用含胎牛血清的高糖培养基漂浮洗涤，调整活细胞浓度至5×107个/ml，充分混匀，于裸鼠背部皮下接种细胞混悬液0.2 ml(含1×107个细胞)。根据接种后细胞移植时间分为5组，每组10只：Ⅰ组为移植后第7天，Ⅱ组为移植后第14天，Ⅲ组为移植后第21天，Ⅳ组为移植后第28天，Ⅴ组为移植后第35天。

1.3 制备靶向超声造影剂 向SonoVue中注入磷酸盐缓冲液3 ml，加入450 μg生物素化酯质。经恒温轻摇、离心后，保留乳白色微泡聚集层；将链霉亲和素加入生物素化的SonoVue中，收集上层微泡，再次加入生物素化的MMP-2鼠抗人单克隆抗体，静置、洗涤，收集上层乳白色微泡。

1.4 CEUS检查 采用百胜MyLab 90超声诊断仪，LA522探头，频率3～9 MHz。先行二维超声检查，选择移植瘤最大切面后转入对比脉冲序列(contrast pulse sequence, CPS)造影模式[5]，机械指数0.16，帧频8 Hz。经模型鼠尾静脉注射SonoVue造影剂0.2 ml，行普通CEUS检查，直至造影剂消退完全；1 h后注入相同剂量靶向造影剂，存储从注入造影剂开始至造影剂完全消退的动态影像，用于脱机分析。采用Qontrast软件获得CEUS相关参数，包括峰值强度(peak intensity, PI)和达峰时间(time to peak, TTP)。

1.5 免疫组化 石蜡标本组织经微波抗原修复后，采用一抗为10%的羊血清封闭1∶100鼠抗人MMP-2单克隆抗体，于室温下孵育2 h，以生物素标识羊抗鼠抗体，室温放置30 min，DAB反应显色，苏木素复染，光镜下观察。对所有动物均完成CEUS检查后，以CD31/PAS免疫组化双染法检测VM，行MMP-2免疫组化检测瘤体内MMP-2抗原。VM为相邻肿瘤细胞围成的紫红色的梭形或管状结构，MMP-2抗原阳性结果为细胞膜或细胞质内有明确棕褐色沉着。由2名病理科主治医师采用盲法阅片，随机选取5个高倍镜视野观察，根据Formwitz半定量积分法计算MMP-2染色区域所占百分比：≤5%，0分；5%～25%，1分；<25%～50%，2分；<50%～75%，3分；>75%，4分。细胞着色程度：无色，0分；浅黄色，1分；黄色，2分；棕色，3分；MMP-2染色区域所占百分比与细胞着色程度的乘积评价MMP-2强度的表达结果：0分(-)；1～4分(+)；5～8分(++)；9～12分(+++)。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计分析软件。计量资料满足正态分布及方差齐性，以±s表示，采用配对t检验比较普通与靶向CEUS的PI和TTP，采用Spearman相关分析靶向CEUS参数与MMP-2强度的相关性。∣r∣值≤0.3表示相关性较差，0.3<∣r∣≤0.6表示中度相关，0.6<∣r∣≤0.8表示有较高度相关性，∣r∣>0.8表示相关性很高。P<0.05为差异有统计学意义。

表1 5组裸鼠普通和靶向CEUS的PI和TTP比较(±s)

表1 5组裸鼠普通和靶向CEUS的PI和TTP比较(±s)

组别PI(dB)TTP(s)Ⅰ组 普通CEUS49.21±12.3887.31±46.20 靶向CEUS71.08±13.7846.41±22.64 t值-3.732.51 P值0.0020.022Ⅱ组 普通CEUS39.71±12.8646.40±14.59 靶向CEUS63.03±17.5626.82±11.71 t值-3.383.30 P值0.0030.004Ⅲ组 普通CEUS58.50±12.8887.31±46.20 靶向CEUS71.36±7.9346.40±22.63 t值-2.682.51 P值0.0150.022Ⅳ组 普通CEUS41.91±13.9654.45±21.60 靶向CEUS58.30±13.1036.37±10.80 t值-2.712.36 P值0.0140.029Ⅴ组 普通CEUS57.86±9.7460.39±16.73 靶向CEUS72.96±8.0744.84±15.66 t值-3.772.14 P值0.0010.046

图1 Ⅱ组裸鼠普通与靶向CEUS表现 A、B.普通CEUS 15 s时瘤体呈低强化状态(A)，TIC显示TTP为53.14 s，PI为19.10 dB(B)； C、D.靶向CEUS 15 s时瘤体呈高强化状态(C)，TIC显示TTP为36.76 s，PI为32.40 dB(D)

2 结果

50只裸鼠移植瘤均建模成功。Ⅰ组裸鼠背部皮下可见小的点状凸起，Ⅱ、Ⅲ组裸鼠背部实性小肿块约5～10 mm，Ⅳ组实性肿块最大径均>10 mm；Ⅴ组部分裸鼠背部皮下的实性肿块周围略见少量出血点，解剖后可见糜烂及出血。

2.1 CEUS参数比较 二维超声观察，实质性肿块周边及其内可见少许星点状血流信号；注射普通及靶向造影剂后，靶向CEUS充盈更迅速，且在瘤体内停留时间更长，瘤体内部及周边的强化更明显，造影剂逐渐充满整个瘤体，7～8 min后造影剂逐渐消退至消失。同组裸鼠中，与普通CEUS参数比较，靶向CEUS的PI升高、TTP减低(P均<0.05)，见表1、图1。

2.2 免疫组化结果 经常规免疫组化SP法染色后，50个移植瘤标本中均可发现不同程度黄染的MMP-2，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中MMP-2呈大小不等的颗粒样棕黄色，且多集中于VM，Ⅳ、Ⅴ组中MMP-2呈棕黄染的小团块状，且多集中于新生血管及细胞外基质中，见图2。

2.3 相关性分析 Ⅰ组、Ⅳ组及Ⅴ组肿瘤组织靶向CEUS的PI、TTP与MMP-2均无明显相关(PI：r=0.38、-0.47、0.17，P均>0.05；TTP：r=-0.74、0.07、-0.44，P均>0.05)；Ⅱ组及Ⅲ组肿瘤组织靶向CEUS的PI与MMP-2呈高度正相关(r=0.86、0.76，P<0.01、P=0.02)，TTP与MMP-2呈高度负相关 (r=-0.84、-0.87，P=0.01、P<0.01)。

图2 免疫组化染色病理图(SP，×400) A.Ⅱ组，MMP-2呈棕色分布于VM(箭)； B.Ⅴ组，MMP-2呈大片棕色(箭)分布于细胞间质和胞浆

3 讨论

CEUS是通过向外周静脉注入超声造影剂，使大量微泡造影剂悬浮于血液，由此实现实时动态地观察组织微血管灌注信息[6]。本研究采用“生物素—亲和素”桥连接法，并以SonoVue为基础制备靶向超声造影剂，发现该造影剂可更特异性地显示病灶微血管灌注全过程，提高CEUS检查裸鼠移植瘤病灶的能力[7-8]。本研究中，与普通CEUS比较，靶向CEUS的PI更高、TTP更短。由于靶向造影剂靶点的抗原可与抗体一对一结合，使其停留在靶点的时间更长，故造影效果优于普通造影剂；另外，恶性肿瘤血管多走行纡曲，且通透性好，故注入造影剂后微泡在血管内流动加速，从而导致PI提前。

卵巢癌是妇科疾病中常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，严重威胁妇女生命及健康[9-10]。卵巢肿瘤的生长依赖于氧及其他营养物质，需通过新生血管来增加血液供应；且新生血管能表达大量特异性抗原，可进一步促进肿瘤组织生长。MMP-2主要通过分解细胞外基质中的各种影响因子来阻止癌细胞进一步扩散，在肿瘤侵袭转移中起关键作用[11-12]。赵小琪等[13]发现，在卵巢癌早期微循环系统VM中，围绕VM管壁的肿瘤细胞分泌大量MMP-2，以溶解VM结构中的细胞外基质成分，是卵巢癌早期VM产生及调控的关键因素，故MMP-2表达水平可作为判断卵巢癌病情及预后的重要参考指标。本研究以裸鼠卵巢癌移植瘤MMP-2为靶点，可使造影剂集聚于肿瘤组织内，有利于靶向CEUS显像；造影剂注入荷瘤鼠体内后，靶向造影剂可与卵巢癌VM中特异性表达的MMP-2靶点相互结合，真实显示肿瘤的灌注特点，故靶向CEUS技术可为早期、无创诊断卵巢癌提供可能[14]。

既往研究[15]表明，在接种3～6周后，移植瘤小鼠逐渐出现胸腹腔积液及恶病质，从而导致荷瘤鼠死亡。由于荷瘤鼠卵巢癌成瘤时间较长，为准确显示靶向CEUS参数与卵巢癌MMP-2的相关性，本研究根据移植时间建立5组SKOV3移植瘤模型，通过免疫组化检查发现5组移植瘤标本中均有MMP-2表达，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中MMP-2多集中于VM中表达，Ⅳ、Ⅴ组中MMP-2多集中于肿瘤的细胞外基质中而较少集中于VM内，提示VM在卵巢癌较早期产生特异性抗原，使卵巢癌致病力及侵袭力增高；而卵巢癌晚期由细胞外基质的新生血管产生抗原为卵巢癌提供营养，加速肿瘤生长。上述发现为治疗卵巢癌提供了新思路，即针对卵巢肿瘤不同生长时期可采用不同治疗方法。

本研究Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ组中肿瘤组织靶向CEUS的PI、TTP均与MMP-2无明显相关(PI：r=0.38、-0.47、0.17，P均>0.05；TTP：r=-0.74、0.07、-0.44，P均>0.05)，而Ⅱ组及Ⅲ组肿瘤组织靶向CEUS的PI均与MMP-2呈高度正相关(r=0.86、0.76，P<0.01、P=0.02)，TTP均与MMP-2呈高度负相关(r=-0.84、-0.87，P=0.01、P<0.01)，提示VM是卵巢癌早期血液灌注的重要影响因子，而卵巢癌晚期由肿瘤新生血管代替VM的供血循环，与上述病理结果一致。

本研究的主要局限性：仅按照移植时间进行分组，发现Ⅱ、Ⅲ组裸鼠卵巢癌靶向CEUS与MMP-2存在高度相关，这些结果是否可代表早期裸鼠卵巢癌靶向CEUS与MMP-2相关尚需进一步探讨。