贵州小关山银花的成分鉴定及其功效成分的分布规律

贾强，江津津，张越华，白杨，王英，张挺，黎扬庆，黄世希，薛志平，高求忠

（1.广州城市职业学院食品系，广东广州 510404）（2.中山大学生命科学学院，广东广州 510275）

山银花(Lonicera hypoglauca)为灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬或黄褐毛忍冬的干燥花蕾或初开的花的统称，是我国常用的中药材之一，中医证实其具清热解毒等功效，可用于治疗急性口腔炎、肝损伤、风热感冒、瘟病发热、热毒血痢和喉痹丹毒等病症[1～4]，也具有抗氧化、抗病原微生物、抗肿瘤、抗过敏、降血脂、抗动脉粥样硬化、免疫调节等药理作用[5,6]，是犀羚解毒丸(Pc)、Vc银翘片和银翘解毒片等多种中成药的主要原料，还广泛应用于饮料、食品、保健品和化妆品等方面。山银花在我国四川、广东、广西、湖南、贵州、云南、安徽、浙江和海南等省均有分布[7]，其化学成分包括有机酸、黄酮、萜皂苷、环烯醚萜、挥发油及微量元素等[8～17]。金银花又名忍冬（Lonicera japonica），与山银花同属忍冬科，形状特征和药理作用有相似。山银花因盛产在我国南方而曾被称为南方金银花，2005年，《中华人民共和国药典》把金银花和山银花分开单列，导致人们对山银花的功效产生疑虑，对我国南方的山银花产业造成了不良影响。2015年，国家药典委仍将金银花和山银花单列，但建议加大对山银花成分、药性等方面的研究[1]。本研究团队对同一产地不同部位、不同花期的山银花植株进行采集，采用 UPLC-QTOF-MS/MS进行分析，一方面探究山银花主要功效成分，为山银花的生理活性研究提供方法，另一方面研究其在一个生长周期内主要功效成分的积累与分布规律，以确定适宜采收期，为我国南方山银花的规范化栽培和采收提供理论依据。本研究采用的超高效液相色谱串联四级杆飞行时间-质谱技术（UPLC-QTOF-MS/MS）能极大限度的保留样品的原始成分，而且样品前处理相对简易，分辨率高并能够提供母离子和碎片离子的精确质量，还能同时实现定性定量分析和快速全面的成分检测，尤其适合一般方法难以检测的水溶性成分。

1 材料与方法

1.1 原料

以贵州绥阳小关山银花不同时期的植株以及植株的不同部位为样本，所采样本为忍冬科植物灰毡毛忍冬Loniceramacranthoides Hand.-Mazz.。具体采集方案及处理方法见表1。

表1 山银花样品的采集表Table 1 Collection of samples of Loniceramacranthoides Hand.-Mazz.

1.2 主要仪器设备

Ultimate 3000 DGLC高效液相色谱仪，美国Dionex公司；DGP-3600SD双三元泵、SRD-3600脱气机、WPS-3000SL自动进样器、TCC3000-RS柱温箱、DAD检测器、Chromeleon6.8数据处理软件；超快速高效液相色谱仪(LC-20AD-XR二元泵、SIL-20AD-XR自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-M20A PDA检测器)，日本岛津公司；四级杆-飞行时间质谱仪(QTOF 5600 plus)，美国AB SCIEX公司；色谱柱：Dionex Acclaim® PolarAdvantageⅡ C18 (3 μm，150 mm×4.6 mm)；数控超声波清洗器(KQ-250DE型)，昆山超声仪器有限公司；系列精密移液器，德国Eppendorf公司；十万分之一电子分析天平(BP211D型)，德国Sartorius公司；超纯水器(Simplicity)，美国Millipore公司；旋转蒸发仪(4001型)，德国Laborota公司；烘箱(UFB400型)德国Memmert公司；乙腈(质谱纯)，美国 Fisher Scientific公司；甲酸(批号：0001408600)，Sigma公司；乙醇(食用级)，广州东征玻璃化学仪器公司；标准对照品(见表2)。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液制备

各称取10 mg的标准对照品用80%色谱级甲醇溶解定容至10 mL容量瓶；各取20 μL上述单一对照品溶液混合，用80%甲醇定容至2 mL，备用。

表2 标准对照品列表Table 2 List of standards

1.3.2 样品供试液制备

取山银花样品粉末，过4号筛，精密称取0.5 g，加80%甲醇50 mL并超声（功率300 W，频率40 kHz）40 min，过滤，滤液浓缩，用80%甲醇定容至10 mL，沉淀过夜，取1 mL上清用0.22 μm微孔滤膜滤过，备用。

1.3.3 分析条件

色谱条件：色谱柱为Dionex Bonded Silica C18(4.6 mm×150 mm，3 μm)；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，按表3所示梯度洗脱；流速为 0.3 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为 3 μL。

表3 流动相梯度洗脱条件Table 3 Gradient elution conditions of mobile phase

质谱条件：离子喷雾电压ion spray voltage 5500 V；离子源气体1 ion source gas1155 psi；离子源气体2 ion source gas 2255 psi；温度temperature 550 ℃；气帘气 curtain gas 35 psi；碰撞气体压力 collision gas pressure 10 psi；离子源：ESI源，分别采用正、负离子模式进行检测。

2 结果与讨论

2.1 山银花提取物UPLC-QTOF-MS/MS成分分析

在 1.3.3所述的 UPLC-QTOF-MS/MS分析条件下，分别在正负模式下对山银花样品同时进行一级和二级扫描得到正、负模式总离子流图，如图1所示。对离子流成分分析及其归属进行分析。

经过与标准谱图库对照、准确分子量对照和裂解碎片质谱图人工解析，再用对照品的裂解碎片质谱图进行比较验证，初步鉴定出贵州小关山银花提取物中的40个化合物，并按色谱峰面积归一法计算各组分的相对百分含量。质谱碎片及化合物鉴定结果见表4。

图1 山银花提取物的正模式（a）及负模式（b）总离子流图Fig.1 The positive mode (a) and negative mode (b) total ion flow diagram of the extract of Lonicera hypoglauca

2.2 山银花中功效成分在不同花期、不同部位的变化规律

杨琼等研究者在 2013年对贵州产山银花的功效成分与花期气候因子的相关性进行了探讨，结果发现不同产地的山银花中的功效成分含量差异较大。花期气候因子（日照、湿度、降雨量和气温）对山银花的有效成分积累的影响较大，建议根据不同的目标选择适宜区域种植山银花[18]。本研究UPLC-QTOF- MS/MS方法，根据各个功效成分离子流响应值分析同一产地， 不同花期和植株不同部位的功效成分分布规律。

表4 贵州绥阳小关山银花中的化合物Table 4 Compounds detected in Lonicera hypoglauca in Suiyang Xiaoguan, Guizhou

2.2.1 花蕾期花和盛花期花中成分的比较

图2 功效成分在花蕾期和盛花期花序的正离子峰面积Fig.2 Composition of positive ion peaks area in the flower bud and flowering parts

图3 功效成分在花蕾期和盛花期的花序的负离子峰面积Fig.3 Composition of negative ion peaks area in the flower bud and flowering parts

不同花期的花都含有绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸、木犀草苷、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷乙、木犀草素、二咖啡酰奎尼酸、槲皮苷、槲皮素、芦丁等成分，如图2和图3所示。从化合物组成来看，没有明显差异；但从含量来看，大部分化合物在花蕾期花中的含量高于盛花期的花，例如绿原酸类、芦丁、山萘黄甙、二咖啡酰奎尼酸、灰毡毛忍冬皂苷乙等化合物，而盛花期花中含量高于花蕾期的化合物主要是川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷乙、灰毡毛忍冬皂苷甲以及苜蓿素等部分化合物。因此，需要利用绿原酸类化合物、灰毡毛忍冬皂苷乙的可在花蕾期采收，需要利用川续断皂苷乙和灰毡毛忍冬甲等成分的可等到盛花期再采收。

2.2.2 花蕾期叶和盛花期叶中成分的比较

花蕾期叶中，除芦丁等小部分化合物外，大部分其他黄酮类化合物含量低于或等于盛花期叶中含量；绿原酸类和咖啡酰奎尼酸类化合物含量也低于盛花期的；但大部分糖苷类和皂苷类化合物在花蕾期叶的含量高于盛花期，如图4和图5所示。故而，山银花的叶也可用于药用和开发功能食品，需利用皂苷类化合物的可采收花蕾期的叶，需利用绿原酸类等化合物的可采收盛花期的叶。

图4 功效成分在花蕾期和盛花期的叶部位的正离子峰面积Fig.4 Composition of positive ion peaks area in bud leaf and flowering leaf

图5 功效成分在花蕾期和盛花期的叶部位的负离子峰面积Fig.5 Composition of negative ion peaks area in bud leaf and flowering leaf

2.2.3 花蕾期枝和盛花期枝中成分的比较

绿原酸类、咖啡酰奎尼酸类化合物、木犀草素、灰毡毛忍冬次皂苷甲在盛花期的枝桠部位含量比花蕾期的枝中高，而多数糖苷类、黄酮类化合物在花蕾期的枝中的含量更高，结果如图6和图7所示。

图7 功效成分在花蕾期和盛花期的枝部位的负离子峰面积Fig.7 Composition of negative ion peaks area in buds branches and flowering branches

2.2.4 花蕾期不同部位（花、叶、枝）中功效成分的比较

图8 成分在花蕾期不同部位（花、叶、枝）的正离子峰面积Fig.8 Positive ion peak area of different parts (flowers, leaves and branches) in bud stage

图9 成分在花蕾期不同部位（花、叶、枝）的负离子峰面积Fig.9 Negative ion peak area of different parts (flowers, leaves and branches) in bud stage

花蕾期的叶中芦丁等黄酮类化合物的含量明显高于花中的含量；叶中绿原酸类化合物的含量与花中含量接近；除木通皂苷D外，花中其它皂苷类化合物的含量均高于叶和枝中；枝中木犀草素、木犀草苷、槲皮苷、糖苷类化合物明显高于花和叶，枝中其它大部分化合物的含量均低于花和叶的含量。总体而言，在花蕾期，花的功效成分含量均高于叶和枝，如图8和图9所示。因此，小关山银花花蕾期的花和叶均适合药用及相关功能食品的开发。

2.2.5 盛花期不同部位（花、叶、枝）中功效成分的比较

图10 功效成分在盛花期不同部位（花、叶、枝）中的负离子峰面积Fig.10 Negative ion peak area of different parts (flowers, leaves and branches) at the flowering stage

盛花期不同部位（花、叶、枝）中的功效成分与花蕾期不同部位的功效成分结果有差异（见图 10），盛花期叶中绿原酸类和芦丁化合物含量明显高于花和枝中；除木通皂苷D外，花中其它皂苷类化合物的含量均高于叶和枝中；枝中的木犀草素、糖苷类化合物、咖啡酰奎尼酸类化合物以及部分黄酮类化合物含量明显高于花和叶，其它大部分化合物的含量低于花和叶的含量。总体而言，在盛花期，花和叶中所含的功效成分含量差异大，若需要利用绿原酸类化合物，叶优于花和枝，但若需要利用皂苷类化合物，花明显优于叶和枝。在贵州小关山银花的盛花期，花和叶均可用于制药及相关功能食品的开发。

3 结论

3.1 本文采用目前处于世界领先水平的UPLC-QTOF-MS/MS联用技术对贵州绥阳小关山银花的化学成分进行分析鉴定，确定了山银花中的 40种成分，是目前山银花研究报道中一次性鉴定成分较多的方法，为天然产物多成分分析和鉴定提供实验方法，也为山银花生理活性研究和综合利用提供理论依据。

3.2 本文也对贵州绥阳小关山银花的不同花期及不同采摘部位的成分及含量变化进行研究，探讨了山银花多种药效成分在不同部位和不同时期的分布规律，初步确定出山银花不同药效成分的不同采收期，为山银花的规范化栽培和采收提供理论依据。本文也对山银花除了花序之外的叶和枝进行了研究，测定结果发现很多功效成分在叶中的含量也很高，所以花和叶均可以作为药用或者用于相关保健食品的研发。研究结果还表明，贵州小关山银花除了含有我国药典里写明的三种成分即绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙外，还含有很多其他功效成分，其中，番木鳖苷A、木犀草素-7-O-芸香糖苷、芦丁(槲皮素-3-0-葡萄糖-(6→1)鼠李糖甙)、山奈酚-3-O-芸香糖苷、木犀草苷、二咖啡酰奎尼酸、槲皮苷、山萘黄甙、木犀草素、苜蓿素等功效成分的相对含量较高。上述研究结果为我国南方地区山银花的种植、推广和进一步的开发利用以及相关保健食品的研发提供科学依据。贵州绥阳小关山银花的其他药效与机理还在进一步研究之中，山银花功效成分的进一步分离，是本研究团队下一步工作的重点，相关研究成果也将陆续报道。