河南省规模化猪场支气管败血波氏杆菌的流行病学研究

张青娴 ，徐引弟 ，王治方 ，朱文豪 ，焦文强 ，李海利 ，方剑玉 ，郎利敏 ，张立宪 ，游 一 ，许 峰 ，郑万录 ，王克领

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002）

支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）是引起多种哺乳动物呼吸道隐性感染及急、慢性呼吸道炎症的病原菌，为严格寄生菌，猪、羊、马、牛、鼠、兔、狗、猫等多种动物都可感染该病，还可感染雪貂、刺猬、狐等野生动物，甚至可以感染人。Bb可引发猪萎缩性鼻炎（Atrophic rhinitis，AR），是猪呼吸道疾病综合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）的重要病原菌之一[1]。Bb 的先期感染可使机体免疫力下降，更容易继发感染其他多种病原，从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度，造成严重经济损失[2-3]。

为了解河南省猪Bb的流行病学情况，采集近年来河南省发生呼吸道疾病的规模化猪场病料组织，对Bb进行分离鉴定，分析其流行概况，为客观评估河南省猪Bb的危害提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源 对2015—2017年河南省各地市的规模化猪场发生明显萎缩性鼻炎症状的猪采集鼻拭子样品，有肺炎症状的猪无菌采集肺组织，部分濒临死亡的病猪采集气管、心血和关节液等组织，共采集到1 022份样品。对于采集到的样品，立即进行Bb的分离鉴定。

1.1.2 试剂、培养基 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tryptic soy broth，TSB）购自Difco公司。麦康凯（MC）琼脂、鲍-姜氏培养基、普通营养琼脂、NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）革兰氏染色液、生化管、新鲜羊血等试剂购自上海生工生物工程有限公司。药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。Taq PCR master mix，DL2000 DNA Marker等 PCR 试剂购自宝生物（大连）有限公司。

1.2 Bb的染色镜检

将经无菌采集的病料划线接种于TSA平皿，置于37℃培养24～48 h后，挑取半透明、光滑且直径1～2 mm的菌落进行革兰氏染色。染色结果显示，Bb为红色的阴性小杆菌或球杆菌，呈现较典型的两极浓染，挑取可疑菌落传代纯化后进行生化及PCR鉴定。

1.3 生化鉴定

按使用说明进行以下生化试验：氧化/发酵（O/F）管、乳糖、葡萄糖、MR、吲哚、VP、西蒙氏枸橼酸钠、硝酸盐还原、硫化氢、触酶、尿素和氧化酶，并接种于绵羊血鲍-姜氏培养基和麦康凯培养基。

1.4 Bb的PCR鉴定

参考GenBank上的flaA基因序列（序列号AF232939）设计 1 对引物：F1：5′-TGGCGCCTGCCC TATC-3′，F2：5′-AGGCTCCCAAGAGAGAAA-3′，扩增目的片段大小为237 bp，由宝生物大连分公司合成。

取40 μL无菌水置于1.5 mL离心管中，挑取单菌落悬浮混匀后，100℃水浴5～10 min，迅速冰浴5 min，置于高速离心机中4℃10 000 r/min离心2 min，取上清作为PCR模板。

配制 25 μL PCR 反应体系：10×Taq Mix Buffer 13 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 1.0 μL，无菌水19μL，模板1μL。PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 30 s，54℃30 s，72℃ 40 s，进行 30个循环；最后72℃延伸10 min；PCR产物于4℃保存。取5 μL PCR产物，经1%琼脂糖凝胶100 V电压下电泳45 min后，用凝胶成像系统观察结果。

1.5 Bb的共感染菌情况调查

将发病猪病料无菌接种于含胎牛血清和NAD的TSA培养基中，分离出可疑菌落，纯化传代后进行PCR鉴定。根据相关文献，设计4对引物（表1），对链球菌（Streptococcus，S.suis）、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）、大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）和巴氏杆菌（Pasteurella multicida，Pm）的菌株，分别进行PCR扩增，确定菌株种类。

表1 Bb的共感染细菌所用引物

2 结果与分析

2.1 Bb的生长培养特性和生化试验

Bb在含血清的TSA平皿上生长成黄白色、圆形、光滑、直径约1 mm的小菌落（图1）。分离菌株在10%绵羊血鲍-姜氏培养基上生长呈珍珠状，周边有边界不清楚的明显β-溶血环，这说明分离菌株都是Bb I相菌（图2）。在1 000倍显微镜下，Bb显示为革兰氏阴性小杆菌或球杆菌，菌体形态一致，有两极着色趋向（图3）。

Bb的生化特征为糖发酵管上有菌膜形成，不发酵任何糖类，西蒙氏枸橼酸钠试验、硝酸盐还原试验阳性，触酶和氧化酶阳性，尿素阳性，不产生靛基质，MR和VP阴性。

2.2 Bb的PCR鉴定结果

由图4可知，分离菌株经支气管败血波氏杆菌flaA基因PCR鉴定后，在237 bp处呈现阳性条带者定为Bb检测阳性。

2.3 Bb的细菌共感染结果

图5为鉴定4种常见共感染细菌的PCR结果，结果表明，阳性结果与预期设想一致。1 022份组织病料中，一共分离出波氏杆菌82株，总分离率只有8.0%，其中，有30份组织病料只分离出波氏杆菌，52 份共感染病料以 S.suis，HPS，E.coli，Pm居多，且鼻拭子分离率低于肺脏组织。

3 讨论与结论

本试验从河南省各地市规模化猪场采集呼吸道病猪的鼻拭子和肺脏、关节等组织样品，样品数量和来源在一定程度上代表了河南省Bb的组织分离特点和实际感染情况。但由于呼吸道与外界接触广泛，容易滋生大量杂菌，且Bb生长慢于许多存在于上呼吸道中的其他细菌，再加上临床大量用药，导致Bb分离率较低[8-10]。Bb是呼吸道的常在菌，本试验分离时不仅能从肺脏、气管、鼻拭子等呼吸系统组织中分离到，还可以从部分病猪的关节、心血分离到该菌，说明Bb可以从呼吸系统进入血液循环，造成全身感染。

一般情况下，Bb毒力较弱，人工感染试验证实，毒力很强的Bb也不能引起明显的或进行性鼻甲萎缩或鼻盘变形[11-14]。目前研究认为，单一的Bb感染并不能导致猪群严重发病，而如果猪群中已感染 Bb，可促进其他多种病原（如 E.coli，HPS，S.suis，猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流感病毒等）的继发感染，造成的损失严重[15-18]。

本研究中Bb与猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪大肠杆菌共感染的比例较高，是否在一定程度上促进S.suis，HPS和E.coli在河南省的流行，有待进一步的研究[19-20]。因本试验在细菌分离的同时，未进行病毒学相关检测，故不排除存在PRRSV，SIV等病毒共同感染的可能。