榛属ycf1基因生物信息学分析

卫永乐，温志芳，刘 芳，张杰伟，黄武刚，兰彦平，程丽莉，曹庆昌，胡广隆

（1.运城农业职业技术学院，山西 运城 044000；2.北京市农林科学院，北京 100093）

叶绿体在植物细胞中具有与光合作用密切相关的一整套基因。鉴于叶绿体基因组的大小、结构和基因型相对保守性，其已成为植物系统发育研究和识别物种的有力工具[1]。目前，某些叶绿体基因的功能已被研究，但有相当一部分基因是未知的，例如一大类基因，即开放阅读框（ORF）。它的DNA序列所编码的特定蛋白质名称和功能仍在摸索中。由于ORF命名方法有诸多不妥，因此，学术界提出了一种新的YCF（假设叶绿体开放阅读框）命名方法。例如，小麦的ORF38与菠菜ORF33的氨基酸序列相似性很高，因此都命名为ycf8基因[2]。

叶绿体DNA（cpDNA）序列已被分类学家广泛用于重建植物系统发育[3]，然而，相对较少的叶绿体基因组区域被用于系统发育研究[4-5]。蛋白质编码基因容易比对，但通常更加保守，缺乏足够的变异来解决种间和种内关系[6-7]。比较基因组的研究表明，叶绿体体基因 ycf1，（hypothetical chloroplast open reading frame 1）可以比matK基因变异度更高[8]。ycf1是叶绿体基因组中第二长的基因（仅次于ycf2），并存在于迄今测序的几乎所有植物叶绿体基因组中[9]。YCF1蛋白的功能是未知的。尽管如此，DRESCHER等[10]研究已经证明，YCF1对植物生存至关重要。ycf1阅读框通常跨越倒置重复区（IR）和小单拷贝（SSC）区域的边界，这在叶绿体基因中是比较特殊的[9]。ycf1基因在系统发育研究中的效用最近才开始探索。NEUBIG等[11]研究表明，ycf1因为其保守的阅读框，是相对容易扩增和比对的。此外，在兰花分类学研究中，ycf1具有类似或仅低于细胞核核糖体DNA内转录间隔区（ITS）的高度变异性，比matK有更优异的分辨率。

榛属植物约有20种，分布在北美洲、欧洲和亚洲；其中，我国有7种及3个变种，主要在东北、华北、西北和西南地区[12]。该属植物的种子含油量大，在东北、华北地区当作油料；坚果可食用，为北方地区常见干果。乔木树种木质硬，用于家具制作及建筑业。二代测序技术的应用加快了榛属叶绿体全基因组研究，榛属叶绿体全基因组的发表[13]为榛属植物叶绿体基因奠定了生物信息学分析与鉴定的基础。

本研究充分利用榛子叶绿体基因组数据库，以榛属ycf1基因家族成员为研究对象，着重分析其基因结构、跨膜区的结构特征和编码区的保守结构域，并与拟南芥及相邻的铁木属经过多重序列比对进行进化和分类分析，旨在为克隆榛子ycf1基因及进一步探索YCF1蛋白的功能奠定坚实的基础。

1 材料和方法

1.1 榛属ycf1基因组、cDNA和蛋白序列的来源

榛属、铁木属及拟南芥的ycf1基因及蛋白序列分别下载自 NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）和 TAIR 数据库（http://www.arabidopsis.org）。利用NCBI的Blast P检索及CDS软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）预测所选蛋白有无YCF1结构域，判断其是否属于该基因家族。

1.2 榛属ycf1基因家族结构分析

利用数据库，获取榛属中ycf1基因家族成员的基因注释。

1.3 榛属ycf1基因家族二级结构及跨膜区结构的预测

ycf1基因家族各成员所编码蛋白质氨基酸的相似性分析[14]、α-螺旋、β-折叠及无规则卷曲等二级结构分析[15]、跨膜区结构[16]分析等分别采用Clustal Omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/），SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 TMHMMServer v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）等软件。

1.4 榛属ycf1基因家族的保守结构域分析

利用软件 MEME（http：//meme-suite.org/）分析拟南芥、铁木属和榛属ycf1基因蛋白的保守结构域[17]。

1.5 榛属ycf1基因蛋白三级结构的预测

榛属和铁木属YCF1蛋白质空间结构模型的同源建模[18]由三级结构预测软件 Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/）的自动建模功能完成。

1.6 榛属ycf1基因蛋白系统进化树的构建

拟南芥、铁木属和榛属的ycf1基因蛋白序列的比对利用Clustal X（2.0）[19]软件进行；将比对结果用MEGA 6.0[20]软件采用Neighborjoining法（bootstrap值设定为1 000）产生系统进化树。

2 结果与分析

2.1 榛属ycf1基因家族成员的评价

利用NCBI数据库提供的Blast程序进行Blast P检索（图1），得到3个榛属ycf1基因和1个铁木属ycf1基因。用保守域预测软件CDS验证了ycf1基因保守结构域的存在，初步确定榛属中3个ycf1基因分别来自华榛、平榛、欧榛；另外，在同科相邻的铁木属的天目铁木中也确定了1个ycf1基因作为对比研究基因，即：YP009331532.1（华榛），AOZ20414.2（欧榛），YP009318292.1（平榛），YP009179114.1（天目铁木）。这几个基因均没有内含子。

2.2 榛属ycf1基因家族的结构分析

表1 YCF1蛋白氨基酸相似性分析%

ycf1基因家族各成员编码蛋白质氨基酸的相似性分析结果表明，欧榛YCF1蛋白和华榛YCF1蛋白之间的相似性最高，达99.74%；欧榛YCF1蛋白和天目铁木YCF1蛋白之间的相似性最低，为97.00%（表1）。二级结构预测分析结果表明，榛属YCF1蛋白中 α-螺旋的比例最高（34.90%～35.89%），其次为无规则卷曲（29.91%～30.25%），再次为β-折叠（25.29%～26.15%），β-转角最低（8.73%～9.04%）（表2）。榛属YCF1蛋白的跨膜区结构分析结果表明，榛属及铁木属YCF1蛋白均含有跨膜区（图2）。

表2 榛属及天目铁木YCF1蛋白的二级结构信息 %

利用保守结构域预测软件MEME分析了拟南芥、铁木属和榛属ycf1基因家族的保守结构域，结果显示，拟南芥、榛属和铁木属ycf1基因家族包含3个保守结构域。其中，基序1的相似度为2.0e-625；基序2和基序3的相似度分别为3.7e-276和4.5e-343（图3）。除了拟南芥ycf1基因At1YCF1，无论在桦木科的榛属和铁木属中，还是在十字花科的拟南芥中，ycf1基因家族均含有3个结构域（图3）。

本研究通过Swiss-Model对榛属及铁木属YCF1蛋白进行同源建模，只发现有5%的序列能与已知模板匹配，即只与转运蛋白AcrB的一个亚基同源。从图4可以看出，Swiss-Model预测的榛属及铁木属YCF1蛋白亚基三级结构的空间结构非常相似，暗示不同桦木科YCF1蛋白在生物学功能上存在相似性。

2.3 榛属YCF1家族蛋白质相似性和系统进化树分析

利用软件MEGA 6.0对8个拟南芥YCF1蛋白、4个榛属及铁木属YCF1蛋白的序列进行系统进化树分析，结果表明，这12个YCF1蛋白序列基本按照物种聚类。YCF1蛋白系统进化树大致上按照科别进行聚类，推测YCF1蛋白在桦木科和十字花科中生物学功能不尽相同。华榛YCF1（YP009331532.1）与欧榛 YCF1（AOZ20414.2）聚类在一起，暗示华榛YCF1可能具有与欧榛YCF1相似的进化过程和生物学功能（图4）。YCF1蛋白在桦木科的进化并没有完全按照属聚类在一起，相对于平榛，天目铁木的YCF1蛋白与欧榛及华榛的关系更近（图 5）。

3 讨论

YCF1具体编码的蛋白质名称和功能仍在探索中。作为叶绿体基因组中2个最大的开放阅读框架之一，ycf1常被认为是失去功能的假基因[21-23]。然而，YCF1的敲除试验显示，YCF1是细胞存活所必需的[24]。杨小飞等[25]研究发现，核基因组编码的RNA结合蛋白PBR1，通过调控拟南芥YCF1在叶绿体中的翻译效率，进而调节3个光合作用复合体的协同生成及稳定性的维持。目前，榛属ycf1基因家族具体功能尚未鉴定。本研究通过生物信息学鉴定榛属ycf1基因家族3个基因均含有跨膜区，均含有3个结构域，表明榛属中不同种间ycf1基因家族中重要结构域存在高度保守性。另外，除了拟南芥ycf1基因编码蛋白At1YCF1，无论在桦木科的榛属和铁木属中,还是在十字花科的拟南芥中,ycf1基因家族均含有3个结构域。推测YCF1的3个结构域在植物诸多生理过程中发挥相似的作用。

进化分析结果表明，华榛YCF1（YP009331532.1）与欧榛YCF1（AOZ20414.2）聚类在一起，暗示他们可能具有相似的进化过程和生物学功能；YCF1蛋白在桦木科的进化并没有完全按照属聚类在一起，相对于平榛，天目铁木的YCF1蛋白与欧榛及华榛的关系更近。基因的进化并非完全与种属分类进化一致，同样的情况出现在兰花磷酸肌醇特异性磷脂酶C基因家族的进化中[26]。由此可见，榛属YCF1各成员的生物学功能还需要进一步分析研究。

4 结论

榛属植物叶绿体基因组中ycf1家族基因，均不含有内含子。榛属YCF1蛋白均含跨膜区和3个高度保守结构域。进化分析结果表明，华榛ycf1与欧榛ycf1可能具有相似的进化过程和生物学功能。