核酸免提取HBV-DNA检测方法性能评价

张春娇，仲崇明

(南京中医药大学连云港附属医院检验科，江苏 连云港222004)

乙型病毒肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种世界性传染疾病[1]。血液中乙型肝炎病毒DNA（HBV－DNA）可反映患者体内病毒活动状况，对临床诊断、判断预后、指导用药及治疗监测起到了重要作用[2－4]。中国是病毒性肝炎的高发地区[5]。快速、简便、特异、灵敏的实验室检测技术对HBVDNA 检测非常重要[6－12]。 目前，检测 HBV－DNA 方法较多，其中，煮沸法操作步骤繁琐，快速而性能良好的方法才能较好适应临床需求。核酸免提取方法操作简便，本文通过分析核酸免提取HBVDNA荧光定量PCR法的精密度、准确度、线性、最低检测限，并将结果与传统煮沸法进行比对，评价该法的检测性能。

1 材料与方法

1．1 质控血清及标准血清为北京康彻斯坦生物技术有限公司产品，15例患者血清标本来源于我院诊治患者。

1．2 仪器与试剂 ABI－7500荧光定量基因扩增仪购于美国应用生物技术有限公司，八连管离心机购于苏州润达生物技术有限公司，免提取核酸法试剂及标准品均购于湖南圣湘生物技术有限公司，批号2017013。煮沸法试剂及标准品均购于西安天隆生物技术有限公司，批号20160902。

1．3 方法

1．3．1 HBV－DNA提取与检测 煮沸核酸提取法，按照天隆公司HBV－DNA荧光定量PCR检测试剂盒说明书要求操作。核酸免提取法，按照湖南圣湘生物技术公司HBV－DNA荧光定量PCR检测试剂盒说明书要求操作。

1．3．2 验证指标及验证方法

1．3．2．1 精密度 选用高、中、低三个浓度阳性血清为待测样本，各重复测定10次，计算SD、CV。以YY/T1182－2010《核酸扩增检测用试剂（盒）》精密度要求（CV＜5%）为评价标准。

1．3．2．2 准确度 具有溯源性定值血清 （北京康彻斯坦生物技术有限公司产品），HBV－DNA含量分别 为 4．6E+06IU/ML，1．41E+03IU/ML 分 别 重 复 3次检测，计算测量平均值与认定值偏差，以YY/T1182－2010《核酸扩增检测用试剂（盒）》准确度要求绝对值偏差不超过0．5个对数数量值为评判标准。

1．3．2．3 线性范围 以煮沸法检测 3．71E+8 IU/ML强阳性血清作为初始标本，依次向下10倍梯度稀释至 3．71E7 IU/ML、3．71E6 IU/ML、3．71E5 IU/ML、3．71E4 IU/ML、3．71E3 IU/ML、3．71E2 IU/ML、3．71E1 IU/ML，每个样本（8 个）分别测定 3 次，取对数值后计算均值，将均值与理论值作线性回归分析（Y为理论值，X为实测值），得出线性回归分析Y=A+BX和相关系数R，以YY/T1182－2010《核酸扩增检测用试剂（盒）》线性要求≥0．98为评判标准。

1．3．2．4 最低检出限 根据 YY/T1182－2010 《核酸扩增检测用试剂（盒）》6．8．2 条款要求，采用乙肝两对半全阴血清稀释康彻斯坦定值质控品1．41E+03IU/ML，稀释47倍，使其达到湖南圣湘生物技术有限公司试剂声明的最低检出限（30IU/ML），进行25次重复检测，以至少22次结果检测出数值为最低检出限通过。

1．3．2．5 将2017年8月13日我院基因扩增实验室接收的15份血清严格按照煮沸法和免提取法说明书操作。比较两种结果一致性，并将阳性结果取对数值，做相关性分析。

2 结果

2．1 精密度 高、中、低3个浓度的精密度变异系数均小于5%。该检测方法符合YY/T1182－2010《核酸扩增检测用试剂（盒）》精密度变异系数CV＜5%的要求，也符合厂家要求，见表1。

表1 精密度评价

2．2 准确度 示值 4．6E+6IU/ML、1．4E+3IU/ML 定值血清测量值均值分别为 5．75E+6IU/ML，1．9E+3IU/ML，符合 YY/T1182－2010《核酸扩增检测用试剂（盒）》5．4．2a 检测国家标准品（或参考品）/国际标准品（或参考品），绝对值偏差不超过±0．5个对数值的要求，见表2。

表2 准确度评价（示值、允许范围、测量值为对数值）

2．3 线性 HBV－DNA 在 3．71E1 IU/ML－3．71E8IU/ML 范围内有良好线性关系 Y=0．987X+0．071，R=0．99，符合 YY/T1182－2010《核酸扩增检测用试剂（盒）》相关系数R≥0．98的要求，也满足试剂盒线性范围要求，如图1。

2．4 最低检出限 示值 30IU/ML（对数值为 1．48）的样本25次检测结果有24次出现定量值，对数均值 1．53，与厂家声明的最低检出限（30IU/ML）相符合。

2．5 两种方法检测结果的比对，以煮沸法为参照X，以免提取法检测结果为Y，两方法结果相关性分析，Y=0．979X+0．134，R=0．99，相关性良好，如图2。煮沸法为阳性的标本，免提取法均为阳性，煮沸法为阴性的标本，有一例免提取法为阳性，且结果为78IU/ML，低于煮沸法的最低检出限100IU/ML。说明免提取法的灵敏度比煮沸法要高。

图1 线性评价

图2 两种方法比对

3 讨论

核酸免提取HBV－DNA实时荧光定量PCR检测性能评估结果显示：高、中、低浓度的精密度变异系数分 0．8%、1．51%和 2．89%低于煮沸法[8，11，12]；准确度与标准品的偏差分别为0．02和0，明显低于煮沸法[8，11，12]；线性验证的相关系数 R=0．99，与煮沸法没有区别；最低检出限为30IU/ML，明显低于煮沸法[8，11，12]的最低检出限．核酸免提取方法可以及时准确检测出低拷贝的病毒，达到早诊断，早治疗的目的。对15例患者血清用两种方法同时进行检测结果显示两种方法相关性良好，说明两种方法都可应用于临床，核酸免提取法有更好的精密度，准确度和灵敏度。本文使用核酸免提取方法精密度、准确度、线性范围、最低检出限均符合YY/T1182－2010《核酸扩增检测用试剂（盒）》的要求，也符合厂家说明书的要求。

目前，国内试剂主要采用煮沸法提取HBVDNA，然后通过实时荧光定量PCR检测DNA载量。 煮沸法测量 HBV－DNA 的性能验证报告[8，11，12，13]显示煮沸法操作步骤繁多，需要高温裂解及高速离心沉淀，很容易造成DNA裂解不完全或离心沉淀不彻底，而造成DNA提取及检测结果误差，吸取废液转移反应管时也很容易造成DNA的丢失及交叉污染。免提取核酸方法使用的核酸释放剂，无需高温裂解，且整个反应过程在一个管中进行，无需移液，减少了反应步骤，缩短了操作时间，提高了工作效率。且避免了核酸的丢失、交叉污染和人工误差，提高了检测结果的准确度、灵敏度和可重复性[14，15]。

综上所述，核酸免提取HBV检测方法具有精密度高，准确度好，灵敏度好，操作简便等优点，实验操作及检测性能能较好地满足临床需求。