新余市甲型H1N1流感病毒H275Y突变监测

刘瑞弘 ，文奇 ，付倩 ，毛尚根 ，龚甜 ，徐刚

(1、新余市疾病预防控制中心，江西 新余338000；2、江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029)

2009年3月新型甲型H1N1流感病毒起源于墨西哥，并迅速传遍全球，导致了本世纪第一次流感大流行[1，2]。经基因序列分析，该病毒是一种4源重组的甲型流感病毒，由禽流感病毒、普通人流感病毒和2种猪流感病毒 （古典1918猪流感病毒、欧亚猪流感病毒）之间重排、重组形成[3-5]，且这种新型流感病毒的NA、M基因与欧亚猪流感病毒株高度同源[6]。最早人们发现新型甲型H1N1流感病毒对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦 （Oseltamivir）敏感，对烷胺类药物耐药[7]。但随着甲型H1N1流感病毒在人群中流行传播，Oseltamivir耐药株不断被报道，截至2010年12月29日，全球已发现316株Oseltamivir耐药株，而且这些毒株均发生了NA蛋白H275Y的突变[8]。本文参考日本学者Nukiwa N研发的RT-PCR-RFLP方法[9]，监测新余市2013年-2015年分离出的部分甲型H1N1流感毒株，分析其NA蛋白是否发生H275Y突变，以筛查出Oseltamivir耐药株。

1 材料与方法

1.1 标本来源 新余市2013年-2014年流感监测工作中所采集的流感样病例咽拭子标本，采用狗肾传代（MDCK）细胞进行病毒分离培养，随机选择新余市2013年分离的8株、2014年分离的7株甲型H1N1流感病毒作为研究对象。选择江西省2009年-2011年分离的、已进行了NA基因测序分析的2株甲型H1N1流感病毒株A/江西安源/SWL541/2009(H1)、A/江 西 东 湖/SWL11036/2010(H1)作为参考毒株，它们均为Oseltamivir敏感株[10]。

1．2 甲型H1N1流感毒株RNA提取 根据Qiagen公司的 RNeasy Mini Kit试剂盒（Cat．No：74106，Lot No：145022097）说明书提取流感病毒毒株RNA。

1．3 RT－PCR扩增NA基因 采用Qiagen公司One Step RT－PCR Kit 试 剂 盒 (Cat：210212，Lot No：148047795) 进 行 RT－PCR 反 应 。 引 物 F：5′－AATCAGTCGAAATGAATGCCCCTAATGAT－3′；R：5′－CGATACTGGACCACAACTGC－3′；RT 反 应 条件 ：60℃ 1min，42℃ 10min，50℃ 30mim，95℃15min。 PCR 循 环 如 下 ：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃30s，35 次循环，72℃ 10min， 在 MJ Research PTC－200仪器上进行扩增，扩增片段长度为224bp。

1．4 RFLP分析 采用NEB公司BclI限制性酶（Lot No：6121305）对扩增产物进行 50℃ 1h酶切。H275Y突变株不能被酶切，而敏感株（野生株）则被BclI酶切成198bp和26bp 2个片段。RFLP反应 体 系 ：BclI 限 制 性 酶 0．45μl，10×NEB 缓 冲 液1μl，H2O 3．55μl，DNA 5μl。

1．5 电泳 One Step RT－PCR扩增产物及其RFLP产物采用3．0%琼脂糖凝胶、北京六一产的DYY－6C型电泳仪电泳 1h，BIO－RAD公司 Universal HoodⅡ凝胶成像仪观察电泳结果。

1．6 统计学处理 应用SPSS 13．0软件进行卡方检验，P＜0．05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 2013年－2015年新余市流感病毒分离情况除2015年未分离到甲型H1N1外，每年B型、H3N2型和甲型H1N1流感病毒共同流行，并交替为优势株 （表1）。新余市2013年－2015年甲型H1N1 流感病毒分离情况分别为 45（3．66%）株、25（2．12%）株和 0（0%）株，年度之间的差异具有统计学意义（P＜0．05），年度流行强度呈下降趋势。

表1 2013年-2015年新余市流感病毒分离情况[n（%）]

2．2 NA基因的RT－PCR－RFLP结果分析 新余市15株甲型H1N1流行株（图1和图2）中，除毒株A/江西渝水/SWL1220/2014（H1）仅见大小约224 bp的RT－PCR产物（未被酶切消化）外，其余14株（含8株2013年、6株2014年流行株）和2株参考毒株的RT－PCR产物均被BclI限制性酶酶切成大小约为198bp、26bp的两个片段，表明毒株A/江西渝水/SWL1220/2014（H1）系H275Y突变耐药株，其他流行株均为敏感株。

图1 新余市2013年部分甲型H1N1流感毒株RT-PCR产物及其RFLP产物电泳图谱

图2 新余市2014年部分甲型H1N1流感毒株RT-PCR产物及其RFLP产物电泳图谱

3 讨论

Oseltamivir被WHO推荐用于治疗甲型H1N1患者的一线药物，也是目前全世界范围内最常使用的抗流感类药物[11]。自甲型H1N1取代原有的H1N1成为季节性流感以来，有关该病毒对Oseltamivir耐药的报道不断增多。中国大陆最早报道的耐Oseltamivir甲型H1N1流感毒株为A/Hunan/SWL3/2009(H1)，系从湖南一输入性病例标本中分离得到[12，13]。此后我国陆续在浙江、云南和福建等省份的流感监测中发现个别Oseltamivir耐药株，这些耐药株共同的NA基因改变是在823位由C变成T，即NA蛋白发生了H275Y替换[14-16]。

以往耐药基因突变位点最常用的检测方法是基因测序，本次研究选用RT-PCR-RFLP方法，简化了实验步骤，采用RT-PCR方法直接扩增目标片段，将扩增产物进行酶切消化，电泳观察结果。该方法巧妙地将上游引物设计成含有一个错配碱基的序列 （导致目的扩增片段的820位碱基由T变成G），甲型H1N1流感Oseltamivir敏感株NA基因经扩增后得到目标片段含有BclI酶切识别序列(TGATCA)，可被酶切成大小约为198bp、26bp的两个片段，而H275Y突变株的扩增片段在相应位置序列为TGATTA，不被BclI酶识别消化，即可筛查出H275Y突变株。

近年来江西省内部分疾控机构对辖区内甲型H1N1流感病毒分离株NA基因进行了相关研究[21-24]，并未筛查到H275Y突变毒株。我们通过对2013年-2014年新余地区的15株甲型H1N1流感病毒NA基因进行RT-PCR-RFLP分析，成功筛选出1株H275Y突变株 A/江西渝水/SWL1220/2014（H1），此突变株为江西省内首次发现的甲型H1N1流感耐Oseltamivir H275Y突变株，当年已被国家流感中心所确定[17]。对该毒株分离标本的病例情况进行调查：患者为8个月大的幼儿，男，2014年3月9日因发烧于水北镇一乡村卫生所就诊，发热不见好转后第2d转诊到新余市人民医院门诊进行治疗，期间体温在38.4℃-39℃之间，咽部、肺部特征阴性，未使用过Oseltamivir等抗流感药物，门诊医生于3月12日采集了患儿的咽拭子。这些调查结果表明，该患儿感染上的H275Y甲型H1N1流感病毒并不是因为使用了Oseltamivir等抗流感药物诱导产生的。在关于全球2013-2014年度流感病毒对NAIs敏感性更新报告中提到，在甲型H1N1流感病毒中发生H275Y替换的比率已达到3.28%（169/5152），在曾携带H275Y甲型H1N1流感病毒的已康复患者中，有82%的人在采集标本前未使用过NAIs抗流感药物治疗，说明这些突变毒株已具备自发产生和传播的潜质[18]。事实上，日本北海道札幌曾发生一起社区聚集性（39人感染）的H275Y甲型H1N1流感疫情事件，美国一年内20个州共检出57人也感染上这种病毒，这些病例均未经治疗或者不具有Oseltamivir暴露史[19，20]。尽管中国大陆对甲型H1N1流感病毒Oseltamivir耐药株的报道数很少，但我们应该加强Oseltamivir耐药株的监测力度，研究并制定防范措施以杜绝流感Oseltamivir耐药株的扩散传播甚至群体性感染事件的发生。