NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与中国朝鲜族2型糖尿病患者下肢动脉硬化的相关性

金光明 朴莲善

延边大学附属医院1医学影像二科，2内分泌科（吉林延吉 133000）

下肢动脉硬化（lower limb arteriosclerosise，LLAS）是2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）最常见的大血管并发症之一，据国外文献报道［1］，T2DM患者并发LLAS发生率达22%～46%，糖尿病病程5年、5～10年和10年以上者，LLAS发病率分别是22.6%、23%和66.7%［2］。临床上一旦出现下肢动脉缺血的症状如间歇性跛行、静息痛、缺血性坏疽等，治疗相当困难，尤其是动脉硬化（ar⁃teriosclerosise，AS）和 硬化 斑 块（arteriosclerosise plaques，ASP）形成引起动脉狭窄、闭塞，会导致下肢的缺血、缺氧，继而引发下肢坏疽、坏死，这是T2DM患者截肢致残，甚至死亡的主要原因，对人类健康危害极大。因此，对LLAS进行早期诊断、早期治疗尤为重要。本课题组经过多年的研究发现，NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与T2DM患者颈动脉硬化、糖尿病肾病及糖尿病视网膜病变这些大血管及微血管病变存在相关性，但对于其与LLAS的关联仍有待于研究。延边地区是我国最大的朝鲜族聚集地，而边疆地区少数民族的健康问题一直是党和国家关心的问题，因此在本实验中，探讨了NADPH氧化酶p22phox亚基基因多态性在中国延边地区朝鲜族T2DM患者中的分布情况，分析该位点的基因多态性与朝鲜族T2DM患者发生的关系，旨在从基因水平上对LLAS的发病进行早期预防、早期治疗，达到造福边疆地区少数民族患者的目的。

1 对象与方法

1.1 对象选取本院住院的朝鲜族T2DM患者298例，其中男170例、女128例，平均年龄（52.56±10.49）岁。T2DM诊断依据1999年WHO诊断标准。根据彩色多普勒超声结果共筛选出AS患者254例，其中无斑块（ASNP）患者191例，有斑块（ASP）患者63例。

1.2 方法

1.2.1 临床资料采集记录受试者年龄、性别、血压、病程、体质指数、吸烟、饮酒与否和实验室检查数据，包括空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、甘油三酯（triglyceddes，TG）、总胆固醇（total choles⁃terol，TC）等。计算体质指数（BMI）=体质量（kg）/［身高（m）］2。

1.2.2 彩色多普勒超声检查选择西门子公司S 2000型多功能彩色多普勒超声诊断仪，探头频率为5～7.5 MHz。受检者检查前静坐或平卧10 min以上，检查前1 h禁止抽烟、饮酒等。选用动脉血管条件模板，取样容积3～5 mm，探头置于血管纵切面中央，声速与血流夹角＜60°。扫查股总动脉、股浅动脉时受检者取仰卧位，扫查腘动脉时取俯卧位，嘱患者双下肢伸直，稍分开。检查时注意两侧对比，利用二维超声显示下肢动脉纵切面的图像，将探头轻轻沿血管走行滑行扫查，测量内-中膜厚度（intima⁃media thickness，IMT），以IMT ≥ 1 mm作为AS诊断标准，以IMT≥ 1.5 mm为ASP形成标准［3］。见图1。

1.2.3 DNA提取和基因型检测应用DNA Purifi⁃cation Kit提取DNA，具体材料为Promega公司提供的Wizard®Genomic。上游引物为：5′⁃TGCTTGTG⁃GGTAAACCAAGGCCGGTG⁃3′，下游引物为：5′⁃AA⁃CACTGAGGTAAGTGGGGGTGGCTCCTGT⁃3′。之后取PCR扩增产物进行酶切反应，将反应后消化片段在2.5%琼脂糖凝胶上电泳，所得条带经紫外灯拍照，判定结果后记录。

图1 AS和ASP彩色多普勒超声对比图Fig.1 Contrast image of AS and ASP in color Doppler ultrasonography

1.3 统计学方法应用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，采用χ2检验进行比较。等位基因和基因型频率采用直接计数法统计，χ2检验评估C、T等位基因的Hardy⁃Weinberg平衡偏离度。Logistic回归分析评估NADPH氧化酶p22phox亚基242位点基因突变和其他危险因素与ASP相关性。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NADPH氧化酶p22phox亚基242位点基因型结果NADPH氧化酶p22phox亚基基因PCR扩增产物片段大小为348 bp，应用限制性内切酶RSA I酶切后，可见3种基因型，出现348 bp一条带的为CC纯合子基因型，出现348 bp、160 bp、188 bp三条带的为杂合子CT基因型，出现160 bp、188 bp两条带的为TT纯合子基因型。见图2。

图2 NADPH氧化酶p22phox亚基242位点基因型凝胶电泳图Fig.2 NADPH oxidase subunit p22phox gene 242 genotype detected by DNA 2.5%agarose gel electrophoresis

2.2 ASNP组和ASP组基因多态性分布的比较NADPH氧化酶p22phox亚基242位点纯合子CC基因频率与杂合子CT及纯合子TT基因进行比较，发现差异存在统计学意义（χ2=3.928，P＜0.05），见表1。

表1 ASNP组和ASP组NADPH氧化酶p22phox亚基242位点CC基因型和CT+TT基因型分布比较Tab.1 The frequencies of p22phox242 genotypes and alleles in ASNP group and ASP group

2.3 一般临床资料比较ASP组SBP（mmHg）显著高于ASNP组［（166.53 ± 15.74）vs.（154.86 ± 15.16）］mmHg（P＜ 0.05），在是否吸烟方面，ASP组吸烟人数比例明显高于ASNP组（P＜0.05），但在DBP、年龄、性别、病程、BMI、FBG和血脂方面无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 ASNP组和ASP组临床资料比较Tab.2 Comparison of clinical data between ASNP Group and ASP Group±s

表2 ASNP组和ASP组临床资料比较Tab.2 Comparison of clinical data between ASNP Group and ASP Group±s

注：BMI，体质指数；SBP，收缩压；DBP，舒张压；FBG，空腹血糖；TC，胆固醇；TG，甘油三酯；LDL，低密度脂蛋白；Cr，肌酐；*P＜0.05

项目年龄（岁）男性［例（%）］女性［例（%）］吸烟［例（%）］饮酒［例（%）］病程（年）BMI（kg/m2）SBP（mmHg）DBP（mmHg）FBG（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）Cr（mmol/L）ASNP（n=191）52.13±10.19 101（52.8）90（47.2）63（33.0）119（62.5）15.76±2.29 24.15±5.01 154.86±15.16 97.35±10.18 10.81±1.43 4.29±1.56 1.48±0.85 2.77±0.39 57.48±38.11 ASP（n=63）54.29±10.11 34（55.4）29（44.6）50（79.4）38（60.9）15.83±2.62 24.11±4.92 166.53±15.74*99.56±10.22 11.60±1.39 4.38±1.40 1.53±0.91 2.75±0.76 55.41±40.06

2.4 ASP危险因素的Logistic回归分析将AS患者视为一个队列人群，以是否合并ASP为自变量，年龄、性别、病程、吸烟、饮酒、BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG以及是否存在C242T突变为因变量，进行logistic回归。表3结果显示，病程和吸烟是ASP的独立危险因素，而C等位基因突变是ASP的风险因素，存在C突变的T2DM患者合并ASP风险增高58%。见表3。

表3 ASP危险因素的Logistic回归分析Tab.3 Logistic regression analysis of risk Factors of ASP

3 讨论

T2DM患者主要表现为糖代谢与脂代谢的双重紊乱，其高血糖和高血脂状态状态会造成血管内血小板聚集，血液黏滞度增高，动脉内皮细胞发生缺血缺氧，最终导致血管屏障功能受损［4］，在彩超上主要表现为动脉IMT弥漫性增厚形成AS，严重者形成ASP，继而造成管腔狭窄、甚至闭塞。

NADPH氧化酶的主要成分是细胞色素b558，它的轻链22 kD多肽（p22phox）被证实与酶活性密切关联，研究发现其可以大量生成氧自由基［5］，氧自由基引起的氧化应激是血管病变发病的基础环节［6］。NADPH氧化酶p22phox亚基242位点的基因突变导致组氨酸转变为酪氨酸，这会产生大量血管内皮活性氧ROS［7］；ROS一方面促进动脉血管基底膜剥脱，造成动脉血管足突细胞死亡［8］，另一方面，它还可以阻止动脉血管基质降解，促进AS甚至ASP的形成，这主要是通过促使动脉血管细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）来完成的。NADPH氧化酶p22phox亚基242位点基因突变造成AS的另外一个原因就是降低了NADPH氧化酶的活性，导致动脉血管细胞的凋亡和NO的合成减少，引起动脉血管痉挛、血小板聚集，斑块形成［9-10］。

种族和生活环境的差异被认为与疾病差异性密切相关，朝鲜族饮食习惯中盐分含量高，男性喜饮酒、吸烟，这些均被认为是造成T2DM的高风险因素。其具体机制为烟草中的氧自由基等物质，会损伤患者的血管内皮，造成血管活性平衡失调，增加患者血管的僵硬度；另外，烟草中某些成分会导致患者的胆固醇代谢紊乱，引起血管壁胆固醇清除下降，胆固醇不断堆积于动脉壁，加快动脉硬化的发展［11］，但在本文中并未得出饮酒与动脉硬化相关的结论，这可能与酒精在某些程度上具有促进循环的作用相关。另外，入选样本数及入选人群中饮酒人数较少也可能是另一个原因。至于病程与ASP之间存在相关性则更好理解，随着病程的延长，T2DM患者代谢紊乱日益加重，造成大血管病变是疾病发生发展的自然过程。

随着基因研究的迅猛发展，越来越多的学者喜欢从遗传、基因水平解释疾病易感性的不同。在本研究结果显示，在AS和ASP的患者中，NADPH氧化酶p22phox亚基242位点纯合子CC基因频率与杂合子CT及纯合子TT基因频率相比，差异显著（P＜0.05），这与我们之前研究的该基因多态性与颈动脉、肾动脉、视网膜动脉及左心室肥厚相关的结果是一致的［12-13］。

通过本研究，笔者认为NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与中国朝鲜族T2DM患者ASP相关，患者中CC纯合子基因是较高的危险因素。检测患者基因型对于筛查高危人群，早发现、早治疗具有重要意义。而CDUS以其价廉、无创、实时可重复等优点，具有广泛的应用前景，但必须要提出的是操作者术水平是影响检测结果的一个重要因素，因此应提高检查者技术水平，按照标准操作流程进行检查。

由于样本含量较小时，实验所得出的肯定性结论应用于临床中，依据不够全面，因此在接下来的研究中，将不断增大样本含量，继续研究NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与T2DM患者糖代谢、脂质代谢等内分泌紊乱的相关性，进一步明确该基因多态性引起T2DM各种并发症的机制。