miRNA 452⁃5P及miRNA 215⁃5P在结直肠癌中的表达及意义

李雪 彭亚诗 舒密 南琼

昆明医科大学第一附属医院消化内科（昆明 650032）

结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，具有高发病率和致死率［1］。结直肠癌早期缺乏特异的临床症状，以及不能获得及时、规范的治疗，多数患者就诊时已处于中晚期。随着近年来分子生物学的飞速发展，发现一类微小RNA（miRNA）与结直肠癌关系密切［2］，且已有研究表明miRNA作为癌基因或抑癌基因参与多种肿瘤的发生、发展，并可作为肿瘤的预后靶分子［3-4］。我们前期基因高通量Miseq测序发现结直肠癌组织中miRNA 452⁃5P及miRNA 215⁃5P存在差异性表达，且miRNA 452⁃5P及miRNA 215⁃5P在结直肠癌中未经报道。因此我们希望对miRNA 452⁃5P及miRNA 215⁃5P 在结直肠癌患者中的表达及临床诊断价值进行更多的研究。期望探索出潜在的结直肠癌诊断价值的分子标志物和治疗靶点。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2017年7-10月在昆明医科大学第一附属医院消化内镜中心行肠镜检查病理诊断为结直肠癌的患者标本30组。患者签署知情同意书，并确定患者未做过放化疗及免疫治疗。年龄：＜60岁14例，＞60岁16例；性别：男16例，女14例；分化程度：低中分化16例，高分化14例；浸润深度：T2 6例，T3～T4 24例；淋巴转移：无淋巴转移17例，淋巴转移13例；Ducks分期：A+B期20例，C+D期10例。

1.2 主要试剂实验中所用Trizol购自上海生工公司；miRNeasy Serum/Plasma kit、miRcute Plus miRNA First⁃Strand cDNA Synthesis Kit，2×Power Taq PCR miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit（SYBR Green）购自TIANGEN公司，所用引物U6、has⁃miR⁃452⁃5P、has⁃miR⁃215⁃5P均购自广州复能公司。

1.3 研究方法根据TIANGEN公司miRNeasy Se⁃rum/Plasma kit试剂盒说明书提取总RNA，实时荧光定量PCR，根据TIANGEN公司提供miRcute Plus miRNA First⁃Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，按照2×Power Taq PCR miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit（SYBR Green）试剂盒说明书提供的方法在RT⁃PCR ABI7300仪上进行实时荧光定量PCR反应，以U6为内参照。反应结束后由配套的计算机软件计算各反应管内的CT值。采用相对定量方法以公式2⁃ΔΔCt来计算每种 miRNAs的相对表达水平。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0软件进行数据处理，所有数据均进行正态性检验，正态性分布计量资料以均数±标准差表示。偏态计量资料以中位数M（P25，P75）表示。两组间正态分布比较采用t检验，偏态分布采用非参数检验Mann Whitney分析。对计量资料作受试者特征曲线（ROC），计算ROC曲线下面积（AUC），AUC 0.5～0.7为诊断价值较差，＞0.7～0.9为诊断价值中等，＞0.9为诊断价值高。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高通量Miseq测序结果结直肠癌组织与正常癌旁组织差异表达miRNA中41种miRNA表达上调，62种miRNA表达下调。其中miR⁃452⁃5P在结直肠癌组织中表达显著下调，miR⁃215⁃5P在结直肠癌组织中表达显著上调（表1）。

2.2 miRNA 452⁃5P及miRNA 215⁃5P在结直肠癌组织中表达miRNA 452⁃5P在结直肠癌组织中表达量是205.19±123.27，在癌旁正常肠黏膜组织中表达量是 576.32± 182.4，miRNA 452⁃5P在结肠癌组织中表达显著下调，且差异有统计学意义（t=6.078，P＜0.001）（图1）。miRNA 215⁃5p在结直肠癌组织中表达量是3.46±1.27，在癌旁正常肠黏膜组织中表达量是2.07 ± 1.22，miRNA215⁃5p在结肠癌组织中表达显著上调，且差异有统计学意义（t=-2.836，P＜0.001）。见图2。

2.3 miRNA 452⁃5P及miRNA 215⁃5P与结直肠癌患者临床病理资料比较miRNA 452⁃5p在结直肠癌中表达与患者年龄、性别、分化程度、肿瘤位置、浸润深度、淋巴转移、Dukes分期、组织分型等均不相关（表2）。miRNA 215⁃5p在结直肠癌中表达与患者年龄、性别、分化程度、肿瘤位置、浸润深度、淋巴转移、Dukes分期、组织分型等均不相关。见表3。

2.4 miRNA 452⁃5P、miRNA 215⁃5P、2⁃miRNAs panel对结直肠癌诊断价值绘制ROC曲线和曲线下面积AUC评估miRNA 452⁃5p、miRNA 215⁃5p及miRNA panel的诊断价值。miRNA 452⁃5p曲线下面积AUC=0.859（P＜0.001，95%CI=0.719～0.999），miRNA 215⁃5p曲线下面积为 AUC=0.879（P＜0.001，95%CI=0.757～ 1.0）。采用二元Logistic回归分析方法将miRNA 452⁃5p、miRNA 215⁃5p引入回归方程，构建2⁃miRNAs panel，2⁃miRNAs panel曲线下面积为AUC=0.930（P＜0.001，95%CI=0.833～1.0）。miRNA 452⁃5p、miRNA 215⁃5p对结直肠癌诊断价值中等；2⁃miRNAs panel对结直肠癌诊断价值较高（图3、4）。

3 讨论

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类生命健康，其发病机制尚未完全明确［5］，癌基因激活与抑癌基因失活、DNA的甲基化、信号通路改变、表观遗传学改变、基因多态性等均可能诱导其发生［6］。miRNAs是近几年分子生物学和表观遗传学研究热点，miRNAs可以通过调控基因的表达来参与并改变重要的生物学过程，如细胞的增殖、侵袭、凋亡、分化与血管生成等［7］。且对转录及转录后翻译也起着重要的调控作用。随着技术提高人们对miRNA基因表达调控作用认识的加深，可以发现miRNAs的表达与许多肿瘤的发生密切相关［8］。如miR⁃940在前列腺癌中表达下调［9］、miR⁃135a在胃癌中表达下调［10］、miR⁃19a在膀胱癌中表达上调［11］、miRNA⁃10b在乳腺癌中表达上调［12］等。可以看出，miRNA在肿瘤的发生发展过程中可能起到类似癌基因或抑癌基因的作用。此外，miRNA在肿瘤诊断、治疗、预后评估中均具有重要价值。

表1 结直肠癌组织与正常癌旁组织中差异表达miRNATab.1 Differential expression of miRNA in colorectal cancer tissues and normal para cancerous tissues

图1 miRNA 452⁃5p在结直肠癌组织与癌旁正常肠粘膜组织中表达量Fig.1 miRNA 452⁃5p expression in colorectal carcinoma tissue and normal intestinal mucosa adjacent to cancer

图2 miRNA 215⁃5p在结直肠癌组织与癌旁正常肠粘膜组织中表达量Fig.2 miRNA 215⁃5p expression in colorectal carcinoma tissue and normal intestinal mucosa adjacent to cancer

表2 miRNA 452⁃5p表达量与结直肠癌患者临床病理特征间关系Tab.2 miRNA 452⁃5p expression and the relationship between the clinicopathological features of colorectal cancer patients

图3 miRNA 452⁃5P及miRNA215⁃5P ROC曲线及曲线下面积Fig.3 miRNA 452⁃5P and miRNA215⁃5P ROC curves and the area under the curve

表3 miRNA 215⁃5p表达与结直肠癌患者临床病理特征间关系Tab.3 miRN A215⁃5p expression and the relationship between the clinicopathological features of colorectal cancer patients

图4 2⁃miRNAs panel ROC曲线及曲线下面积Fig.4 2⁃miRNAs panel ROC curves and the area under the curve

目前研究显示结直肠癌中存在多个miRNA的差异表达，其与临床病理特征、治疗效果、诊断等均密切相关。在转移性结直肠癌患者血浆中miR⁃122、miR⁃200a、miR⁃200b、miR⁃200c、miRNA⁃181c表达上调，miR⁃122水平增加与“不良”预后亚型相关，miRNA⁃181c可以预测Ⅱ期结直肠癌的复发，另外，所有miR⁃200家族成员均与患者的生存期，预后亚组、临床特点相关，尤其miR⁃200c其可以独立的预测淋巴结转移、肿瘤复发以及预后［13-15］。

本研究结果提示miR⁃215⁃5P在结直肠癌组织中表达上调，说明其可以促进结直肠癌细胞增殖，转移和侵袭，起到类似癌基因作用。miR⁃452⁃5P在结直肠癌组织中表达下调，说明其可以抑制结直肠癌细胞增殖、转移、侵袭等作用，在结直肠癌中起到类似抑癌基因的作用。我们通过与临床病理资料分析，miR⁃452⁃5P与miR⁃215⁃5P表达与年龄、性别、分化程度、肿瘤位置、浸润深度、淋巴结转移、组织类型、Dukes分期等均无明显关系（其原因可能是由于样本量小、个体差异和肿瘤特性等因素有关）。但到目前为止miR⁃452⁃5P及miR⁃215⁃5P未见在结直肠癌相关报道，miR⁃452⁃5P及miR⁃215⁃5P在其他肿瘤中表达及机制很大程度上也还不清楚，特别是结直肠癌的发生发展过程中可能存在新的调控机制及生物学作用。因此，我们将在今后的试验中增大样本量对miR⁃452⁃5P及miR⁃215⁃5P如何调控下游靶基因在结直肠癌发生发展过程中发挥作用进一步探讨。

本研究绘制 miR⁃215⁃5P、miR⁃452⁃5PROC 曲线及曲线下面积AUC，结果显示：miRNA452⁃5p曲线下面积为0.859，miRNA215⁃5p曲线下面积为0.879。并采用二元Logistic回归分析方法将miRNA452⁃5p、miRNA215⁃5p引入回归方程，构建2⁃miRNAs panel，2⁃miRNAs panel曲线下面积为0.930，对结直肠癌诊断价值较高。本研究的研究对象为组织仍为有创检查，下一步我们将研究结直肠癌患者外周血液中 miR⁃215⁃5P、miR⁃452⁃5P表达，期望探索出结直肠癌无创诊断价值的早期分子标志物。

综上所述，本研究揭示miRNAs可以作为结直肠癌的重要生物学标记，其表达水平可以预测结直肠癌患者的预后，但是目前miRNAs对结直肠癌的诊断与治疗在临床上仍面临着巨大的挑战，不过随着对miRNAs研究的深入，miRNAs很有可能成为新的肿瘤标志物，并可用于结直肠癌的诊断与治疗。