花生AhFAD2—2基因的克隆与表达分析

唐桂英 王芳 徐平丽 单雷

摘要：脂肪酸脱氢酶（FAD）能够调节膜脂中不饱和脂肪酸的水平来提高植物对不良环境的耐受性。本研究利用RT-PCR方法从花生中克隆到2个脂肪酸脱氢酶基因，命名为AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。序列分析结果显示，2个基因的ORF区均为1 152 bp，编码383个氨基酸；cDNA水平上有12个碱基差异位点，其中只有483位和720位的碱基差异引起氨基酸的改变；它们的基因组序列大小分别为5 089 bp和5 090 bp，在5′UTR区分别存在一个3 821 bp和3 822 bp的内含子。qRT-PCR分析结果显示，这两个基因为组成型表达，其中在叶片中的表达量最高，花和根中次之，茎与种子中表达量最低。低温处理下，幼苗叶片中AhFAD2-2基因的表达量在0.5 h时迅速增加，至12 h达最高值，随后表达量逐渐下降，说明AhFAD2-2的表达响应低温胁迫诱导。本研究结果可为花生的抗寒性遗传改良提供理论依据。

关键词：花生（Arachis hypogaea L.）；AhFAD2-2基因；低温胁迫；基因表达

中图分类号：S565.2：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）06-0027-08

Abstract Fatty acid desaturase （FAD） can improve the stress tolerance of plants by regulating the contents of unsaturated fatty acids in membrane lipids. Two genes， named AhFAD2-2.1 and AhFAD2-2.2， encoding fatty acid desaturase were cloned from peanut by RT-PCR. Sequence analysis revealed that the ORF of both two genes were 1 152 bp， which encoded 383 amino acids. There were 12 different nucleotides between the two cDNA squences， among which， only the sites located at 483 and 720 lead to the differences at amino acid level. The gDNA sizes of the two genes were 5 089 bp and 5 090 bp， respectively. One 3 821-bp intron and one 3 822-bp intron were identified in the 5′UTR region of AhFAD2-2.1 and AhFAD2-2.2. The result of qRT-PCR showed that AhFAD2-2 was constitutively expressed， and the expression level was the highest in leaves， followed by flowers and roots， and the lowest in seeds. Under the low-temperature treatment， the expression level of AhFAD2-2 in peanut leaves increased significantly at 0.5 hour， reached the peak at 12 hour， and then decreased gradually. The results indicated that AhFAD2-2 might be responded to low temperature in peanut. This study could provide theoretical bases for the genetic improvement of cold resistance in peanut.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）； AhFAD2-2 gene； Low-temperature stress； Gene expression

低溫是限制植物分布，影响植物生长发育的重要因素。当环境温度降低至不适宜植物生长的程度时，植物细胞中的不饱和脂肪酸含量及其组成会发生改变，以维持细胞膜的流动性和稳定性，降低逆境对膜结构的损害，增强植物抗寒性[1，2]。因此，研究植物细胞中不饱和脂肪酸的代谢，对于阐明植物的抗寒机制具有重要意义。

FAD2（fatty acid desatuase 2）是一种定位在内质网中的Δ-12去饱和酶[3-5]，主要功能是催化单价不饱和脂肪酸C18∶1Δ9（油酸）在C12位脱氢，生成二价不饱和脂肪酸C18∶2Δ9，12（亚油酸）。大多数高等植物叶细胞中亚油酸（C18∶2Δ9，12）和亚麻酸（C18∶3Δ9，12，15）含量占脂肪酸总量的70%以上，非光合组织根与种子中所占比例也较高。尽管其他脂肪酸去饱和酶也参与了叶细胞中部分不饱和脂肪酸的合成，但大多数不饱和脂肪酸还是由内质网来源的FAD2和FAD3催化合成，因此，FAD2一个最重要的功能是为整个植物体细胞中膜脂和储藏脂的装配提供所需的亚油酸，以及进一步去饱和产生亚麻酸[6]。研究发现，植物中存在两类FAD2基因，一类主要在种子中表达，参与储藏脂中脂肪酸去饱和；另一类为组成型表达，可能参与决定植物膜脂脂肪酸的不饱和程度，其活性对植物抗寒能力具有一定影响[7，8]。目前已经在多种植物中分离出了FAD2基因，该基因受冷胁迫诱导。在低温胁迫下，佛手香橼叶的FAD2[9]、棉花叶的FAD2-3和FAD2-4[10]、油橄榄果实的FAD2-1和FAD2-2[7，11]及马齿苋叶的FAD2-2的表达量随着温度的降低显著升高[12]。在冷冻胁迫下，白杨PtFAD2过表达转基因株系的存活率明显比非转基因株系和转基因下调株系要高[13]。拟南芥fad2突变体缺乏脂肪酸脱氢酶活性，叶绿体膜中多不饱和脂肪酸含量显著减少；在6℃条件下，植株生长受到抑制，最终枯萎、死亡[14]。

本研究克隆到两个新的AhFAD2-2基因，并进一步利用qRT-PCR方法分析了它们在不同器官组织及在低温胁迫下的表达情况，以期为该基因的功能及花生抗寒性研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

花生品种：鲁花14号，由本实验室保存，种植于山东省农业科学院饮马泉试验田，用于根、茎、叶、花与种子的取材；低温处理的材料种植在花盆中，选生长3周、长势一致的花生幼苗，于8℃条件下处理0（对照组）、0.5、1、4、12、24、48 h以及恢复常温处理6 h和24 h，取叶片。所取样品于液氮中速冻，置-80℃冰箱贮存，用于RNA或DNA提取。

1.2 菌株及质粒

大肠杆菌DH5α（Escherichia coli）和pEASY-T3克隆载体购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 试剂药品

限制性内切酶、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit购自宝生物工程有限公司（大连）；2×TransTaq High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix和TransStart Green qPCR SuperMix UDG购自全式金生物技术有限公司（北京）；凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒和DNA分子量标准购自GENERAT生物技术有限公司（上海）；TRIzol Reagent 购自赛默飞世尔科技公司（上海）；PCR扩增引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；DNA序列测定由山东省农业科学院测序中心完成；其余生化试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.4 AhFAD2-2基因的cDNA和gDNA克隆

以鲁花14号幼嫩叶片为材料，分别利用Trizol 法和CTAB法[15]提取花生叶片总RNA和DNA；参照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit说明方法经反转录合成cDNA第一条链。依据转录组数据库中ESTs拼接序列设计基因ORF（Open Reading Frame）区扩增引物AhFAD2-2orfF和AhFAD2-2orfR，及基因组扩增引物AhFAD2-2gDNA-F1和AhFAD2-2gDNA-R1（表1），PCR反应体系：PCR Mix 10 μL，cDNA/gDNA 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，总体积为20 μL。反应程序为：94℃预变性4 min；然后94℃变性30 s，59℃复性30 s，72℃延伸1 min（gDNA为5 min），30个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析后，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物连接到克隆载体pEASY-T3上，转化并酶切验证后送山东省农业科学院测序中心测序。

1.5 AhFAD2-2基因的序列分析

利用http：//web.expasy.org/protparam/ 在线分析AhFAD2-2基因编码蛋白的氨基酸组成、理论分子量和等电点；蛋白质序列的跨膜区分析和信号肽分析分别利用TMHMM2.0软件http：//www.cbs.dtu.dk/services/TM-HMM/和Signal 4.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）进行。系统进化树构建利用MEGA5.0完成，采用Neighbor-Joining法，进行1 000次Boot-strap分析。

1.6 AhFAD2-2基因的表达模式分析

以花生根、茎、叶、花和不同发育时期种子，以及不同时段低温处理花生的叶片为材料，提取总RNA，并反转录合成cDNA第一条链，利用荧光定量PCR方法，以qRT-PCR-FAD2-2F1和qRT-PCR-FAD2-2R1为引物，以UBI2为内参基因（表1），反应体系采用TransStart Green qPCR SuperMix UDG说明书中20 μL体系，每个样品3个技术重复。利用ABI 7500 PCR仪，采用2步法进行。反应程序为：第一步95℃ 10 min；第二步95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。扩增曲线和Ct值由仪器自带软件自动生成。基因表达量的计算采用2-ΔΔCt方法进行。

2 结果与分析

2.1 AhFAD2-2基因cDNA和gDNA克隆

以鲁花14号叶片cDNA为模板，利用特异性引物AhFAD2-2orfF和AhFAD2-2orfR扩增到约1.1 kb的片段（图1）。经测序分析，获得序列长度为1 152 bp的两条cDNA序列，它们之间有12个碱基位点的差异，其中只有483位和720位的碱基差异导致了氨基酸水平上的不同。将其分别命名为AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。

以特异性引物AhFAD2-2gDNA-F1和AhFAD2-2gDNA-R1扩增AhFAD2-2基因的gDNA序列，得到一段约5 kb的产物（图2）。经测序分析，得到两条长度分别为5 089 bp和5 090 bp的序列。

2.2 AhFAD2-2基因及编码氨基酸序列分析

AhFAD2-2基因序列分析表明，两基因ORF区均为1 152 bp，编码383个氨基酸，推测相对分子量分别为43 839.27和43 829.29，等电点均为8.80。两基因gDNA长度分别为5 089 bp和5 090 bp，5′UTR区分别包含一个3 821 bp和3 822 bp的内含子。

利用NCBI网站中CDD（Conserved Domain Database）数据库对AhFAD2-2蛋白进行保守结构域分析，结果表明，AhFAD2-2蛋白中含有保守结构域Membrance-FADS-like。此结构域为FAD超家族所共有的，推测该蛋白是FAD家族成员（图3）。

以TMHMM2.0分析AhFAD2-2氨基酸序列，发现在49～71、81～103、176～198、223～243和250～272氨基酸处存在着5个跨膜结构域（图4），且每两个结构域之间的距离较短。通过亚细胞定位分析发现AhFAD2-2蛋白结合在内质网上。利用SignalP 3.0软件分析，发现该蛋白无信号肽结构，推测AhFAD2-2编码的蛋白质不是分泌蛋白。

运用PROSITE数据库分析，发现花生FAD2-2氨基酸序列的105～111、141～147位和315～321位有3个高度保守的组氨酸簇，分别为HECGHH、HRRHH、HVAHH（图5）。研究表明，在FAD2家族中，这3个组氨酸簇是FAD2蛋白发挥功能必不可少的活性位点，同时还被预测为铁原子的配体。相邻组氨酸簇之间的距离也是一定的，这一特点在其他物种FAD2蛋白中也存在[16]。

将AhFAD2-2氨基酸序列与已知的其他物种FAD2氨基酸序列进行比对，构建Neighbor-Joining系统进化树（图6）。植物中FAD2基因主要分为两类，一类是组成型表达的FAD2，一类是种子特异性表达的FAD2。不同物种FAD2氨基酸序列分析显示，与花生AhFAD2-2聚在一支的均属于组成型表达的FAD2。其中，AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2分别与来源于B基因组和A基因组的野生种花生FAD2-2亲缘关系最近；其次与大豆GmFAD2-2（Glycine max，L29215）、棉花GhFAD2-2（Gossypium hirsutum，Y10112）和柠条锦鸡儿CkFAD2（Caragana korshinskii，ABP49577.1）的亲缘关系较近，而与拟南芥AtFAD2（Arabidopsis thaliana，NP_187819.1）、油菜BnFAD2（Brassica napus，AAF78778.1）、向日葵HaFAD2（Helianthus annuus，OTG00389.1）亲缘关系相对较远。花生AhFAD2-2与AhFAD2A、AhFAD2B聚在不同分支，后者属于种子特异性表达FAD2，说明AhFAD2-2是不同于花生AhFAD2A和AhFAD2B的另一类基因。

2.3 AhFAD2-2基因表达分析

以UBI2为内参基因，对AhFAD2-2基因在根、茎、叶、花、不同发育时期种子以及低温处理不同时段叶片中的表达模式进行qRT-PCR分析。结果显示，在花生的根、茎、叶、花和种子中均有AhFAD2-2基因表达，但在不同组织中表达量有所差异。叶中的表达量最高，其次是花和根，在茎和种子中该基因的表达量最低（图7）。并且发育前期种子内表达量明显高于后期（图8）。推测花生AhFAD2-2基因编码的蛋白可能在膜脂的脱饱和代谢中发挥作用。

低温胁迫的叶片中，处理0.5 h时AhFAD2-2表达量迅速升高，随着处理时间的逐渐延长，表达量逐渐增加，处理12 h时表达量最高；之后表达量表现为下降趋势，但在48 h后表达量明显高于对照未处理组。恢复常温后表达水平略微降低（图9）。表明AhFAD2-2显著响应低温胁迫处理。

Gm：大豆Glycine max；Ck：柠条锦鸡儿Caragana korshinskii；Mt：苜蓿Medicago truncatula；Ca：鹰嘴豆Cicer arietinum；Ah：花生Arachis hypogeae； Ai：野生花生Arachis ipaensis；Ad：野生花生Arachis duranensis；Cc：木豆Cajanus cajan；Tm：旱金莲Tropaeolum majus；Hb：风车藤Hiptage benghalensis；Rc：蓖麻Ricinus communis；Pt：毛白杨Populus tomentosa；Lu：亚麻Linum usitatissimum；Pl：芍药Paeonia lactiflora；So：菠菜Spinacia oleracea；Po：马齿苋Portulaca oleracea；Pc：荷兰芹Petroselinum crispum；Cp：Crepis palestina；Ct：红花Carthamus tinctorius；Vg：斑鸠菊Vernonia galamensis；Ha：向日葵Helianthus annuus；Co：金盏花Calendula officinalis；Oe：油橄榄Olea europaea；Vf：油桐Vernicia fordii；Pg：石榴Punica granatum；Gh：陆地棉Gossypium hirsutum；Mp：水黄皮Millettia pinnata；Pam：鳄梨Persea americana；Bo：琉璃菊Borago officinalis；At：拟南芥Arabidopsis thaliana；Bc：埃塞俄比亚芥Brassica carinata；Bj：芥菜型油菜Brassica juncea；Bn：油菜Brassica napus；Br：芜菁Brassica rapa。

3 讨论与结论

目前的研究发现，许多植物中存在多个拷贝的FAD2基因，且不同拷贝具有不同的表达模式，可将它们分为组成型表达和种子特异性表达两类[17]。如向日葵HaFAD2-1和大豆FAD2-1A、FAD2-1B在发育的种子中特异表达，而HaFAD2-2、HaFAD2-3和大豆FAD2-2为组成型表达，由此推测它们在不同部位的表达与功能是密切相关的[18，19]。在红花中发现的11个拷贝的FAD2基因也验证了这一推测[20]。目前，本课题组在花生中克隆到4個拷贝的FAD2基因，分别是AhFAD2（AhFAD2A和AhFAD2B）以及AhFAD2-2（AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2）。AhFAD2A和AhFAD2B主要在种子中表达，参与花生种子储藏脂中不饱和脂肪酸的合成[21]。本研究中克隆到的AhFAD2-2，在系统进化树中与AhFAD2A和AhFAD2B聚在不同分支，距离较远；而与组成型表达的一类基因聚在一起，其中该分支中研究较多的大豆GmFAD2-2、棉花GhFAD2-2的表达响应低温胁迫，可能参与膜脂不饱和脂肪酸的合成。说明AhFAD2-2是花生中新的一类脂肪酸去饱和酶FAD2。

植物通过脂肪酸去饱和酶引入双键，调节生物膜膜脂不饱和脂肪酸的水平，改变生物膜的流动性，从而响应并适应低温环境。大量研究证明，膜脂脂肪酸不饱和度主要取决于FAD的种类和数量[17]。油菜硬脂酰ACP去饱和酶（stearoyl-ACP desaturase）基因SAD受低温诱导后表达量显著升高，冬性抗寒品种SAD上调幅度明显高于春性冷敏感品种[22]。大豆中FAD2-2C基因的表达量明显受到低温环境的影响，生长在温度较低条件下大豆的FAD2-2C表達量比对照提高了8倍[23]。Kargiotidou等对棉花组成型表达基因FAD2-3和FAD2-4研究时发现，这两个基因的表达水平均受低温胁迫诱导，并且叶片中二价不饱和脂肪酸的种类与含量也显著增加[10]。将番茄的LeFAD3基因超表达，4℃处理的转基因番茄幼苗中，LeFAD3基因的转录水平大幅升高，叶和根中C18∶3显著增加，C18∶2显著降低，且叶绿体膜系统中的超微结构比对照完整性好，PSⅡ最大光合效率也明显高于对照[24]。这些研究表明，脂肪酸脱氢酶在植物低温胁迫响应中起重要作用。本研究中AhFAD2-2的表达增强与低温胁迫具有明显相关性，推测该基因参与花生抗寒反应，但其抗低温胁迫的机制仍需进一步深入研究。

参 考 文 献：

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