藏獒犬白介素18基因的克隆及原核表达

宋世斌，胡永浩，何 强，敬淑燕 ，仝保全

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃农业职业技术学院;3. 兰州原生獒园)

藏獒，又名藏狗、番狗、羌狗。原产于我国雪域高原，广泛分布于青藏高原海拔3 000～5 000 m的高寒牧业区和半农半牧区，如西藏、青海、甘肃、四川等地，是经过藏族牧民的严格选择和培育而形成的优秀犬品种，是我国唯一的一个大型犬种，属国家二级保护动物，被列为世界名犬之一。随着人们生活水平日益提高，犬类动物在人类的生活中越来越占据重要的部分，如作为伴侣动物、警犬、救护犬等，但是狂犬病、犬细小病毒病、犬瘟热和犬腺病毒病等各种病毒性疾病严重危害着犬的健康和生存，也困扰着我国的养犬业，加之各种原因造成的免疫程序失败，使病毒病的预防和治疗显得尤为重要。白细胞介素18(Interleukin-18,IL-18)最初名为干扰素诱生因子或白细胞介素1γ，是一种重要的细胞免疫调节因子。1995年日本学者首次从中毒性休克的鼠肝脏中分离并克隆出该因子。现已了解它有重要的免疫调节和保护功能；它可诱生IFN-γ及Fasl表达，增强IL-2和GM-CSF的活性；可与许多细胞因子相互作用，IL-18 mRNA在多种器官、组织、细胞中均可测到。在抗肿瘤、抗感染及免疫调节中起着积极的作用，在许多疾病的基础性研究和临床应用中有重要前景。国内已克隆了犬、猪、牛、人、鸡等哺乳动物的IL-18，藏獒犬的还未见报道，因此本研究克隆并成功的表达了该基因，为后续藏獒犬的蛋白的功能、生物学活性及抗病毒药物及免疫预防研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

Trizol Reagent、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶等购自Promega公司；反转录试剂盒购自invitrogen公司；淋巴细胞分离液、Phenol Chlorform购自sigam；dNTP、RNA酶抑制剂、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DNA 2000marker 等均购自TaKaRa公司；PBS、D-Hanks洗液、RPM1640培养液、3.8的%柠檬酸钠溶液由笔者所在的实验室配制；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物

藏獒犬来源于兰州原生獒园。

1.3 细胞因子诱导转录及总RNA提取方法

1.3.1 藏獒血外周血淋巴细胞(PBMC)的分离与刺激诱导 无菌采取藏獒的新鲜外周血，以3.8%柠檬酸钠抗凝，用淋巴细胞分离液分出PBMC，用D-Hank’S液洗涤细胞，再用完全的1640培养基调整细胞浓度至1×107个/ml。将细胞现在培养箱中培养1 h，然后加入LPS 5 ug/mL+PHA 2 ug/ mL，继续在50 mL/LCO2培养箱中37℃刺激诱导24 h。

1.3.2 PBMC总RNA提取 在PBMC诱导6 h、12 h、24 h不同时段收获细胞，用PBS洗1次，然后用Trizol Reagent从PBMC中提取总RNA，并用电泳观察所提RNA的完整性后置-70℃冻存备用。

1.4 基因克隆方法

1.4.1 引物的设计 参照GenBank上已登录的犬IL-18(NM001003305)序列，利用PrimerSelect软件和Oligo软件设计了引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

基因克隆引物：上游引物：5ˊ-ATGGCTGCTAACCTAATAGAAG -3ˊ

下游引物：5ˊ-CTAGCTCTTGTTTTGAACAGTG -3ˊ

表达引物：上游引物：5ˊCGGGATCC ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAˊ-3ˊ

上游引物：5ˊCGGAATCC TCA AGC TTG CCA AAG TAC AT -3ˊ

1.4.2 RT反应条件的选择 将提取的RNA进行反转录，在经DEPC处理的PCR管中加入模板RNA8 ul，50 pmol/uL Oligo(dT18)1 uL，dNTP 1uL 、DEPC 水总体积12 uL ，混合物65℃温浴5 min后，迅速置冰上冷却。后再加入第一链合成缓冲液、DTT及RNA核酸酶抑制剂，然后按照试剂盒的invitrongn转录试剂盒的操作步骤进行。

在RT产物中加入适量的dNTP、PCR buffer和引物，最后补水到50 uL。根据退火温度设计了如下程序进行PCR扩增：94 ℃50 s，48 ～55 ℃50 s，72 ℃40 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.4.3 基因的克隆及阳性质粒的鉴定 按照以上条件进行扩增，并将PCR产物回收后克隆入PGEM-T Easy载体，重组质粒经PCR和EcoRI酶切鉴定，选取阳性克隆送上海生物工程有限公司测序。

1.4.4 藏獒白介素18基因的序列分析 采用DNAstar序列分析软件对藏獒犬IL-18基因与GenBank中的IL-18基因进行序列分析。利用生物信息学方法对克隆分子的遗传进化关系和序列结构进行分析。

1.5 藏獒犬pET-30a-IL-18重组表达质粒的构建

利用合成的表达引物，以pGEM- -IL18质粒为模板，PCR扩增目的片段，利用Hind III和EcoRI限制性内切酶双酶切 PCR产物和Pet-30质粒，分别回收、纯化目的基因片段和载体片段，再利用T4 DNA连接酶，将IL18基因定向插入pET-30a载体，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，挑取单菌落接种于含Kan LB培养基，37℃过夜摇菌，提取质粒，经 Hind III 和EcoRI进行酶切鉴定后，送上海生工生物工程有限公司测序，测序正确的重组质粒命名为pET-30a-IL18。

1. 6 藏獒犬pET-30a- IL-18诱导及Western - blot分析

测序正确的重组质粒命名为pET-30a-IL18转化BL-21细胞后，挑取单克隆接种于含Kan+ LB，收集沉淀，超声破碎仪粉碎细菌，收集上清和沉淀并分别进行电泳；部分经SDS-PAGE电泳检测后转印到PVDF膜上，进行Western bloting检测，分析蛋白的表达情况。用PBST洗涤3次，每次10 min，加入1∶1000稀释的鼠抗his IgG(一抗)，室温作用1h，洗涤3次后，加入1∶8000羊抗鼠HRP IgG 二抗，室温孵育1h，再用上述方法洗涤后加加入DAB显色液，均匀滴加到PVDF膜上，显色。

2 结果2.1总RNA提取的完整性

提取的总RNA电泳后呈瀑布状分布，有5S、18S、28S三条带，说明所提取的总RNA 没有降解(见图1)。

图1 总RNA提取结果

2.2 基因的克隆

用PHA、LPS诱导PBMC扩增出特异的IL-18基因，大小约为58 2bp(见图2)；在不同时段表达的目的基因量不同，在诱导24h的外周血淋巴细胞中目的基因的表达量最大。

图2 IL-18 RT-PCR扩增产物电泳结果 M、.DNA分子质量标准；1、没有诱导的，2,3,4诱导的不同时间扩增的目的产物

2.3 序列测定及分析

对序列结果进行分析，所克隆藏獒IL-18基因与参考犬序列的同源性为100%，氨基酸序列的同源性为100%。测序的藏獒犬IL-18基因序列及推导的氨基酸序列如图3所示, 藏獒犬IL-18基因的全长为582 bp, 包含一个完整阅读框, 共编码194个氨基酸的前体蛋白, N端前36个氨基酸残基为信号肽, 成熟蛋白为149个氨基酸, 推测其分子量为18.10 KD，等电点为6.112。

图3 藏獒犬IL-18序列及推导的氨基酸序列

2.4 序列的比较分析及进化分析

从NCBI上下载家犬、猫、猪、牛、羊、人的IL-18的核酸序列及本研究中所克隆的IL-18核苷酸序列(命名为KeLongzangaoIL-18)，利用MEGA 5.1软件构建系统发育树(图4)，结果表明，藏獒的IL-18基因在系统发生关系上与家犬的同系，与猫的也较近而与人的亲缘关系较远。将所测的IL-18基因序列与GenBank下载读取的人和猫、猪、羊、牛、人的IL-18基因序列进行核苷酸同源性比较得出的核苷酸同源性分别为100%、91.2%、91.1%、88.5%、89.3%、84.4%。 ，表明IL-18存在明显种属差异性。

图4 人、藏獒犬及其他动物IL-18核苷酸序列绘制进化树

2. 5 pET-30a-IL-18重组质粒的鉴定

以质粒 pEGM- IL-18为模板， PCR 扩增后得到约 477 bp左右的基因片段， 酶切后插入原核表达载体pET-30a，得到pET-30a- IL-18重组质粒。pET-30a质粒及PCR片段经 Hind Ⅲ 和 BamHⅠ酶切后得到约为 4. 7 kb 的载体片段和约477bp 的IL-18基因片段，测序证实目的基因ORF准确插入到载体中 (图5)。

图5 重组表达质粒的PCR和酶切鉴定1. DL2000Marker； 2. EcoRI和 HindIII双酶切产物；3. PCR产物；

2.6 pET-30a- IL-18重组蛋白表达情况和 Western bloting 结果

收集的细胞经超声处理后SDS-PAGE电泳后(如图6)，表达产物大约为25Kd ；Western bloting检测结果pET-30a-IL-18出现约25Kd的目的条带，说明目的蛋白得到正确表达(图7)。

图6 SDS-PAGE 分析pET-30a- IL18表达结果 1、没有诱导的空载体，2，3超声的沉淀

图7 pET-30a- IL18 westbloting结果1、2 表达的pET-30a - IL-18表达的蛋白

3 讨论与分析

IL-18是一种新发现的分布广泛的细胞因子，具有多种生物学功能，其中对机体的免疫调节和抗肿瘤作用已受到研究者们的极大关注，有研究证明在抗微生物感染，尤其是在抗病毒免疫方面具有重要的潜在应用价值。动物的研究落后于人类和小鼠，但是近些年来也取得了迅速的进展。国内外对于IL-18 的研究大多围绕着猪牛羊和禽类等动物展开，藏獒犬的还未见报道。本研究根据GenBank发表的犬IL-18基因序列，设计1对引物，利用RT-PCR技术从诱导的藏獒犬外周血中扩增出藏獒犬的IL-18基因，并克隆鉴定；测序结果表明本研究中克隆了藏獒犬IL-18完整的阅读框，大小为582bp，所克隆的基因与参考序列的同源性为100%，这说明IL-18基因较保守。将藏獒犬IL-18基因核苷酸序列与人和其他5种动物的IL-18核苷酸序列比对分析并绘制进化树发现，藏獒犬与犬、猫的亲缘关系较近同源性在91～100%之间；而与牛羊的同源性达到88～89.3%；相比较与人的较远，但是也达到了84.4%。这也表明IL-18 存在种属的差异性，亲缘关系越近同源性越高。

大肠杆菌表达系统具有表达量高、成本低、易于分离纯化和放大制备等优点。原核表达系统在基因表达技术中占主要地位，是现阶段实现生物技术产业化的有效途径。大肠杆菌表达系统具有强转录及翻译信号，主要以不溶性包涵体形式目的蛋白，仅有极少量以可溶性蛋白形式存在于胞浆中，这反映了原核表达系统高效表达外源基因的一般规律。目的蛋白以不溶性包涵体形式表达，既是目的基因在宿主细胞中过度表达的表现，也是高表达量目的蛋白不被菌体内蛋白酶降解的需要，保证了表达蛋白的活性及后续制备及可行性。藏獒犬IL-18基因全长编码的194个氨基酸中，前36个氨基酸为信号肽，本试验中成功的构建了去信号肽的藏獒犬IL-18原核表达载体、在诱导剂的作用下能够诱导大量的IL-18表达，westbloting验证表达的蛋白是正确的,这对工业化生产重组藏獒犬IL-18具有重要的意义，也为我国重组基因的产业化生产奠定了基础。

藏獒犬作为伴侣及观赏动物，在我国的养殖范围不断扩大，但是病毒病对养殖藏獒犬业影响较大，病毒如细小病毒、狂犬病毒、犬瘟热等破坏了犬的免疫系统，出现发热发炎等症状。藏獒犬IL-18是一种重要的细胞因子，具有免疫调节活性、能诱导NK细胞、T细胞产生IFNγ，还能促进T细胞增殖、诱导Th1细胞的细胞毒及NK细胞杀伤活性，因而其具有较强的免疫增性，成为免疫佐剂及增强剂研究的热点，而且在疾病的预防和治疗方面具有很大的潜在的应用价值，值得做更深入的研究。因此犬IL-18可望成为疫苗的一种重要的细胞免疫佐剂，在提高犬体抗感染力、增强灭活苗或基因工程苗免疫作用方面具有广阔的应用前景。研究表明，在通常情况下，机体内IL-18表达量甚微,不可能直接提取纯化，只有通过基因工程技术才能大量生产重组IL-18。显然,本研究为进一步研究和开发利用IL-18奠定了基础。