针刺内关、心俞穴对心肌梗死大鼠模型血管内皮生长因子表达及心肌组织结构的影响

徐文博 唐关敏 翟昌林 钱钢 胡惠林 朱良枫

研究表明，在急性心肌梗死早期，心肌组织与血液内会分泌一些保护心肌的物质等，能在一定程度上修复受损的心肌组织[1-2]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 作为这些保护心肌的物质代表之一，在心肌侧支循环建立中有重要作用。给予外源性VEGF，可使犬缺血部位心肌侧支循环改善[3]。另有研究证明，VEGF具有剂量依赖性舒张冠状动脉作用。在猪心肌梗死模型中，VEGF可引起侧支循环区域冠状动脉微血管的舒张反应[4]。如何能让这些细胞因子通过自身调节发挥有益于梗死心肌组织的作用，是目前研究的热点。本研究尝试采用针刺相关穴位的干预方法，探索调节VEGF表达以及保护急性心肌损伤新的有效方法，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物及建模 选取12～16周龄的清洁级雄性Wistar大鼠72只，体重200～250g，购于浙江大学医学院实验动物中心。所有对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。实验前在清洁级动物实验中心适应性喂养1周，分笼饲养于标准实验房（22℃），给予规律光照，自由饮食饮水。将大鼠以10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉，气管插管，呼吸机辅助通气（呼吸机型号：VentElite小动物呼吸机55-7040）。常规消毒，铺巾，于左侧第4肋间行横切口，开胸暴露心脏，剪开心包，在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1.0～2.0mm处用5/0线结扎冠状动脉前降支，结扎后可见左心室前壁失去原有光泽，变苍白，并出现搏动减弱，心电图检测（心电图机型号：上海泰益VE-100）可见肢体导联R波振幅明显升高，随后出现Ⅰ、aVL ST段明显抬高则证实制备急性心肌梗死模型成功。将大鼠开胸后在冠状动脉前降支处只穿线而不结扎制备假手术模型。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和针刺方法 （1）实验分组：将72只大鼠采用抽签法分为6组（假手术组、模型组、内关组、心俞组、内关+心俞组、穴位旁组），每组12只。假手术组：假手术组不予针刺干预；模型组：建立心肌梗死模型，不予针刺干预；内关组、心俞组及内关+心俞组：建立急性心肌梗死模型后24h起分别针刺内关穴、心俞穴及内关和心俞穴；穴位旁组：建立模型后24h起给予针刺双侧内关与心俞穴连线中点处处理。（2）针刺方法：大鼠内关及心俞选穴参考《实验针灸学》（内关穴：双侧于尺骨、桡骨缝间离腕关节约3mm处；心俞穴：双侧肩胛骨下角平对第五胸椎棘突处）[5]，采用华佗牌SDZ-Ⅱ型电子诊疗仪电针相应穴位，针刺入穴位约0.5cm，频率1Hz，电流强度为0.1mA，强度为肢体轻微颤动为度，1次/d，时间30min，连续针刺7d。

1.2.2 VEGF检测 各组到实验终点时，经下腔静脉抽取静脉血，以ELISA法对各组进行VEGF检测。

1.2.3 心肌病理结构的检测 取各组大鼠左心室心肌损伤区组织，采用透射电子显微镜（型号：日本JEM1230，显微倍数：20 000倍）分组检测左心室心肌损伤区心肌细胞的形态结构以及心肌组织病理结构。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组大鼠血浆中VEGF的表达 见图1。

图1 6组大鼠血浆中VEGF的表达

由图1可见，假手术组、模型组、内关组、心俞组、内关+心俞组、穴位旁组VEGF分别为（36.05±7.81）、（66.21 ±10.10）、（77.58 ±12.12）、（80.10 ±10.45）、（97.38±11.55）、（68.36±13.45）pg/ml，其中模型组、内关组、心俞组、内关+心俞组、穴位旁组VEGF均高于假手术组，差异有统计学意义（t=7.70、9.34、10.90、14.08、6.79，均 P＜0.05）。内关组、心俞组、内关+心俞组VEGF均高于AMI模型组及穴位旁组，差异有统计学意义（t=2.38、3.16、6.64，1.69、2.28、5.37，均 P＜0.05）。内关 + 心俞组 VEGF 均高于内关组及心俞组，差异有统计学意义（t=3.90、3.66，均P＜0.05）。6组间其它比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 各组心肌损伤区心肌组织电子显微镜检查结果 见图2。

图2 各组心肌损伤区心肌组织电子显微镜检查结果（A：模型组；B：内关组；C：心俞组；D：内关+心俞组；E：穴位旁组）

由图2可见，模型组心肌纤维排列不整齐且不紧密，心肌纤维膜破坏损伤，部分线粒体肿胀，线粒体嵴损伤，胞浆有较多空泡。内关组心肌纤维排列较紧密整齐，可见肌小节，线粒体较丰富，少量线粒体肿胀且线粒体嵴损伤，胞浆有少量空泡。心俞组心肌纤维排列较紧密整齐，可见肌小节，线粒体较丰富，少量线粒体肿胀且线粒体嵴损伤，胞浆有少量空泡。内关+心俞组心肌纤维排列较紧密整齐，肌小节较清晰，线粒体较丰富，少量线粒体肿胀且线粒体嵴损伤，胞浆有少量空泡。穴位旁组心肌纤维排列欠紧密，部分纤维损伤，线粒体较丰富，部分线粒体肿胀且线粒体嵴损伤，胞浆有少量空泡。

3 讨论

大量动物实验及临床实践证明，针刺相关穴位对心肌缺血有着很好的治疗作用。任路等[6]观察发现电针内关穴能缓解家兔心肌缺血的症状，提示针刺内关穴具有多途径多环节保护心肌缺血的作用；马铁明等[7]的研究发现，针刺内关穴能诱导急性心肌缺血家兔心肌细胞VEGF的表达，有助于促进多种血管活性物质合成，促进血管舒张，抑制血栓形成和血管平滑肌细胞增殖；肖延龄等[8]研究发现针刺内关对心肌缺血区VEGF合成及VEGF mRNA的表达具有促进作用，通过对VEGF及VEGF mRNA的调节，可能是其促进血管新生的途径之一；翟昌林等[9]的研究发现，针刺预处理心肌梗死大鼠可能通过抑制内质网应激对心肌再灌注损伤起到保护作用，其机制可能与调节p38信号通路磷酸化水平相关；钱钢、胡惠林等[10-11]的研究表明，电针预处理心肌梗死大鼠可以抑制相关蛋白释放从而减轻心肌缺血再灌注损伤。上述多数研究只停留在单一穴位的研究，不同穴位间各自单用与合用比较，其疗效往往存在协同增强的作用。李梦等[12]观察发现，电针内关、心俞穴，可以改善注射了垂体后叶素的急性心肌缺血大鼠模型的心率变异性；杜慧静等[13]发现，电针针刺内关、心俞穴早期能促进急性心肌梗死大鼠心肌细胞SDF-1、VCAM-1表达，从而证实了穴位之间的协同作用，但上述研究仅仅停留在观察细胞因子表达的水平上，缺少微观病理结构变化的证据。

本研究对心肌梗死大鼠模型采取单一针刺内关、心俞穴与联合针刺内关+心俞穴的不同干预方案，观察心肌梗死大鼠模型外周血中VEGF的表达水平，同时观察心肌梗死区域心肌的微观结构变化。研究发现，针刺内关、心俞穴，可显著提高心肌梗死大鼠外周血中VEGF的表达，联合针刺内关+心俞穴较单一针刺内关、心俞穴，心肌梗死大鼠外周血VEGF的表达更加显著；同时电子显微镜的观察结果显示，联合针刺内关+心俞组，心肌梗死区域的心肌细胞损伤程度低于单一针刺组。以上结果提示，针刺内关、心俞穴可能通过上调VEGF的表达对心肌梗死后心肌损伤起保护作用，且联合针刺内关+心俞穴其保护作用更为显著。

本研究的不足之处在于针刺内关、心俞穴上调VEGF的具体机制尚不明确，我们猜测针刺可能通过调节神经内分泌系统，改变某些生物酶的活性，从而调节相关血管再生因子的表达，最终达到促进心肌血管再生，改善缺血心肌供氧，减少心肌凋亡。上述的猜测需要我们通过更加深入的研究来证明，以期为针刺在心肌缺血治疗领域中的应用及推广提供更多科学的依据。