二氨基庚二酸激活NOD1信号通路对心肌缺血再灌注损伤的影响

柳磊，张武，李召彬，李滨，徐贯杰，王园园，王金星

(1.河北医科大学第三医院 心脏外科，河北 石家庄 050051；2.安岳县人民医院 心血管内科，四川 资阳 642350； 3.河北医科大学第三医院 麻醉科，河北 石家庄 050051；4.河北医科大学第三医院 实验中心，河北 石家庄 050051)

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

1.2 心肌缺血再灌注模型的建立

将40只C57/BL6雄性小鼠随机分为4组，即假手术组、I/R组、DAP组和I/R+DAP组，每组10只。I/R小鼠模型按照徐多娇等[9]所述的模型制作方式进行制作，麻醉后通过左胸廓切开术将心脏暴露并外露，将左前降支冠状动脉(LAD)进行结扎，然后将心脏立即放回胸腔内，并进行关胸缝合。对假手术小鼠进行相同的手术操作，但只穿线不结扎。缺血30 min后，剪开结扎线，然后将心肌再灌注24 h。DAP组和I/R+DAP组小鼠在冠状动脉结扎前30 min腹腔注射DAP(100 μg·只-1，生理盐水稀释)。假手术组和I/R组小鼠注射等剂量的生理盐水。24 h再灌注后通过腹膜内注射三溴乙醇(1 mg·只-1)处死小鼠，获取心脏组织。

1.3 实时定量R PCR

1.4 心肌梗死面积评价

1.5 免疫组化分析

1.6 细胞凋亡测定

1.7 蛋白质印迹分析

1.8 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析。计量数据以平均值±标准差表示，两组间差异比较采用t检验，多组间的差异采用单因素方差分析(ANOVA)分析中的LSD检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌缺血再灌注损伤对NOD1表达的影响

为了研究NOD1是否参与心肌缺血再灌注损伤，对小鼠进行30 min缺血和24 h再灌注。qPCR和蛋白质印迹分析显示，与假手术组比较，I/R组NOD1 mRNA表达水平和NOD1蛋白水平显著高于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明心肌缺血再灌注损伤显著地增加NOD1 mRNA表达和NOD1蛋白表达(图2)。

2.2 DAP激活NOD1对心肌梗死面积的影响

在缺血前对心肌缺血再灌注小鼠注射NOD1的激动剂配体DAP，再灌注24 h后测量梗死面积，结果显示，I/R组梗死面积比值明显高于假手术组，且I/R+DAP组小鼠梗死面积最高，差异具有统计学意义(表1)。

图2假手术组与I/R组NOD1mRNA和蛋白的表达

由于DAP组与假手术组的危险区面积/左心室面积和梗死面积/危险区面积比值小于0.01，因此未在表中显示，检验结果显示DAP组与假手术组相比无显著性差异。

表1I/R组与I/R+DAP组心肌梗死情况

组 别n(危险区面积/左心室面积)(梗死面积/危险区面积)I/R组100.12±0.010.58±0.07I/R+DAP组100.22±0.020.6±0.05t值4.1171.832P值0.0220.198

2.3 DAP激活NOD1对心肌细胞凋亡的影响

假手术组与DAP组的心肌细胞凋亡数量差异无统计学意义(P>0.05)。然而，在心肌缺血再灌注损伤24 h后，与假手术组相比，I/R组和I/R+DAP组TUNEL阳性细胞数显著增加，I/R+DAP组阳性细胞数最多，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图34组小鼠心肌细胞凋亡情况

2.4 DAP激活NOD1对I 6炎症反应的影响

2.5 DAP激活NOD1对N κB p65磷酸化的影响

3 讨 论