梯度交联水凝胶用于骨髓间充质干细胞的三维培养与分化

张宁，李小佩，肖倩茹，曲凯云，张静逸，黄宁平

(东南大学 生物科学与医学工程学院/生物电子学国家重点实验室，江苏 南京 210096)

本研究主要探索梯度交联水凝胶材料对骨髓间充质干细胞(MSCs)3D延伸、生长和分化等行为的影响，为将来基于此类梯度交联水凝胶进行多种细胞的3D培养及其在医学上的应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 MSCs的获取培养

1.3 在水凝胶上接种MSCs接种

探索不同接种浓度的MSCs在梯度交联水凝胶的生长情况(A:5×103孔-1；B:10×103孔-1；C:20×103孔-1；D:40×103孔-1)，使用同样的方法对细胞骨架进行免疫荧光染色，观察不同接种浓度的细胞在梯度交联水凝胶里的迁移，使用激光共聚焦显微镜进行拍照观察。对得到的照片使用Image J软件进行细胞骨架覆盖度的定量分析，具体方法为通过软件测量荧光信号在整张图片的覆盖百分比。

1.4 MSCs的诱导及分化

2 结 果

2.1 MSCs在水凝胶上的3D生长

MSCs在梯度交联水凝胶和普通水凝胶的生长情况如图1。具有梯度交联的水凝胶更适合MSCs的3D生长，细胞迁移到水凝胶内部，形状为纺锤形(图1A)，随着培养时间的延长，在第3天的时候，细胞可以生长进入到水凝胶内200 μm处。而在普通水凝胶上，MSCs是单层的2D平面生长(图1B)，并且随着培养时间的延长，细胞也没有发生迁移贯穿长入水凝胶内部。

A. 基于梯度交联水凝胶的MSCs生长情况;B. 基于普通水凝胶的MSCs生长情况

A. MSCs behavior on gradient hydrogel; B. MSCs behavior on homogeneous hydrogel

图1水凝胶对MSCs生长行为的影响

Fig1MSCsmorphologyondifferenthydrogel

2.2 在梯度交联水凝胶上不同接种浓度MSCs的3D生长

在梯度交联水凝胶上分别接种了不同浓度的MSCs，细胞数量依次为5×103、10×103、20×103、40×103孔-1。MSCs培养3 d后对细胞骨架进行免疫荧光染色。图2和图3分别为在梯度交联水凝胶内细胞生长的侧面视野图和正面视野图。由图2可以看出，随着细胞接种浓度的增大，贯穿长入水凝胶内部的细胞数量越多。当接种浓度为40×103孔-1时，水凝胶内部的细胞数量最多(图2D)。对MSCs细胞生长的正面视野图使用ImageJ进行细胞骨架覆盖度的定量分析，得到不同接种浓度细胞的定量生长情况(图4)。在梯度交联水凝胶上，接种数量为5×103、10×103、20×103、40×103孔-1的细胞骨架定量覆盖度分别依次为(8.58±0.50)、(22.71±11.01)、(24.36±3.95)、(34.30±6.55)%。因此，接种细胞数量越多，细胞骨架的覆盖度越大。

2.3 MSCs在梯度交联水凝胶里的诱导分化

MSCs在梯度交联水凝胶里3D培养的分化潜能见图5。细胞培养3 d后更换诱导培养液进行培养，1周后进行碱性磷酸酶染色和油红染色，观察干细胞的成骨和成脂分化。培养10 d后，细胞贯穿进入凝胶内部。由图5可以看出，实验组碱性磷酸酶(紫色)和脂滴(红色)的表达量均比对照组要高，这说明MSCs即使贯穿进入到水凝胶内也可以向成骨(图5B)和成脂分化(图5D)。在梯度交联水凝胶建立的3D培养微环境中，MSCs的干细胞分化潜能没有受到影响。

3 讨 论

A. 5×103孔-1；B. 10×103孔-1；C. 20×103孔-1；D. 40×103孔-1

图2不同接种浓度的MSCs在梯度交联水凝胶里的生长情况(侧面视野)

Fig2MSCsbehaviorwithdifferentseedingdensityongradienthydrogel(sideview)

A. 5×103孔-1；B. 10×103孔-1；C. 20×103孔-1；D. 40×103孔-1

图3不同接种浓度的MSCs在梯度交联水凝胶里的生长情况(正面视野)

Fig3MSCsbehaviorwithdifferentseedingdensityongradienthydrogel(overview)

A. 5×103孔-1；B. 10×103孔-1；C. 20×103孔-1；D. 40×103孔-1

图4MSCs在梯度交联水凝胶上细胞骨架覆盖度

Fig4ThequantifiedsurfacecoverageofactinofMSCsongradienthydrogel

图5在梯度交联水凝胶中MSCs的成骨(A.对照组和B.成骨分化诱导组；碱性磷酸酶染色)和成脂(C.对照组和D.成脂分化诱导组；油红染色)分化

Fig5Theosteogenic(A.Control,B.Inductionmedium)andadipogenic(C.Control,D.Inductionmedium)differentiationofMSCsongradienthydrogel

Anseth课题组基于不同弹性模量的水凝胶，探索了其对干细胞向成骨和成脂分化行为的影响[12]。在本研究中，我们观察了细胞在3D空间里的诱导分化情况。MSCs贯穿长入水凝胶后对其进行成骨和成脂的诱导分化，分化诱导组的碱性磷酸酶(紫色)和脂滴(红色)的表达量均比对照组要高，这说明即使MSCs贯穿进入到水凝胶内部也可以向成骨和成脂分化。在梯度交联水凝胶建立的3D培养微环境中，MSCs的干细胞分化潜能没有受到影响，有利于后期研究干细胞在3D空间里的分化。

综上所述，本研究初步探索了基于梯度交联水凝胶的骨髓间充质干细胞的三维培养,显示具有交联梯度的水凝胶更适合干细胞的3D培养；而在普通水凝胶上，大多数细胞都是2D平面生长。同时在水凝胶的3D培养体系中，MSCs的干细胞分化潜能可以得到很好的维持。