MALDI-TOF MS对草莓中铜绿假单胞菌和黏质沙雷氏菌的检测

魏 超, 代晓航, 郭灵安, 刘 炜

(四川省农业科学院分析测试中心,四川成都 610066)

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是一种软电离质谱,可以通过检测微生物蛋白质的特异性达到鉴定微生物的目的[1-2]。微生物蛋白质体系主要受遗传因素控制,受培养基组份、培养时间以及培养条件等外部因素影响较小,所以微生物蛋白具有稳定性和特异性[3]。MALDI-TOF MS采用基质解析电离的方式获得微生物特异性蛋白质指纹图谱,对图谱中蛋白质标识峰信息与标准数据库进行多重比较达到对微生物鉴定的目的,因此MALDI-TOF MS在微生物检测上可以获得更多微生物的信息[4]。国外已经将MALDI-TOF MS方法用于人类致病菌的快速检测鉴定中[5-6]。草莓为蔷薇科多年生草本植物,在园艺学上将其划分为浆果类,是当今消费量十大水果之一[7]。草莓食用肉质部分为花托发育,可食用部分占98%,高含糖量、高含水量的特点使其成为微生物的天然培养基,且草莓表面凸凹,存在微观疏水区,大部分清洗方法无法将果蔬表面的微生物彻底清除[8],微生物的大量附着且较难清洗干净增加了其食用风险。在欧盟HACCP体系中草莓表面致病微生物的监测是其关键控制点,国际食品法典对多种生食果蔬微生物的检测方法及限量进行了规定,速冻草莓相关检测也在其中,且鲜果草莓微生物检测也进入国际标准化优先名录[9]。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为条件致病菌,可引成人及免疫力低下婴幼儿起呕吐、腹泻、头痛等症状[10],且极易产生耐药性,是人和动物常见的感染菌[10-13]。此菌生长温度范围较宽,该菌具有4℃不生长而在42℃可以生长的特点[9],这一特点可以用来对其进行选择性培养。黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)属于肠杆菌科沙雷属,一般见于水、土壤、腐烂的蔬菜、肉和淀粉丰富的食品上,是住院病人重要条件致病菌[10],可引起败血症和尿道感染[14-15],黏质沙雷氏菌在普通营养琼脂培养基上可以产生灵菌红素(prodigiosin)和吡羧酸(pyrimine)两种不同的色素,最适的生长温度37～40℃、NaCl水溶液质量浓度0～7 g/L[13]。本实验根据两种微生物的特性设计分离方法,采用MALDI-TOF MS对分离的黏质沙雷氏菌和铜绿假单胞菌进行鉴定和蛋白质图谱特异性筛选,旨在对草莓的食用风险分析、卫生事件溯源及农产品微生物检测方法优化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草莓50份,基地样品25份,采自成都的新津、大邑、双流、郫县、天府新区25个草莓基地;超市及菜市场样品25份,采自成都5个超市和8个菜市场,抽样方式离散型随机分布,基本覆盖成都城区。

缓冲蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)、营养琼脂、铜绿假单胞菌杆菌显色培养基、四硫磺酸盐煌绿增菌培养基(tatrathionate broth,TTB),北京陆桥生物技术有限公司;乙腈、乙醇,均为色谱纯,美国Fisher Scientific公司;甲酸,色谱纯,美国Tedia公司;α-氰基-4-羟基肉桂酸(2-cyano-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic acid,CHCA),美国Sigma公司;实验用水均为去离子水;生理盐水、ID 32 E肠杆菌科微生物鉴定试剂条,生物梅里埃公司。

1.2 仪器与设备

AXIMA Confidence型 MALDI-TOF MS仪,日本岛津公司;ATB微生物鉴定仪、比浊仪,生物梅里埃公司;DHP 9082型生化培养箱,宁波东南生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 铜绿假单胞菌与黏质沙雷氏菌的分离

铜绿假单胞菌分离：称取25 g样品,225 mL BPW均质后36℃培养18 h,取1 mL BPW增菌液于TTB中42℃选择性增菌培养24 h,增菌液划线于铜绿假单胞菌显色平板36℃培养24 h,选取表现阳性菌划线于营养琼脂培养基,36℃培养24 h后进行质谱鉴定和生化鉴定。

黏质沙雷氏菌分离：称取25 g样品于225 mL无菌水中均质,40℃培养16 h,取0.25 mL涂布于营养琼脂培养基,38℃培养24 h,对红色或粉色菌落进行营养琼脂纯化,36℃培养24 h后进行质谱鉴定和生化鉴定。

1.3.2 微生物的生化鉴定

挑取1.3.1节纯化单菌落至生理盐水比浊管中,在比浊仪调至0.5麦氏浊度(梅里埃标准管校正),用移液器移取55μL至ID 32 E试剂条样杯中,36℃培养24 h后由ATB微生物检定仪读出鉴定结果。

1.3.3 MALDI-TOF MS鉴定与相关分析

用10μL接种环取2个单菌落菌量加入1.0 mL φ(乙醇)=70%的水溶液φ(乙醇)=70%的溶液中,震荡30 s,离心1 min弃上清液,加入φ(乙醇)=75%的水溶液75μL震荡20 s,常温40 kHz超声10 min,加入75μL乙腈震荡均匀,离心1 min取上清液1μL点至靶板,加入1μL CHCA,晾干。

质谱条件：检测器线性模式 电子倍增管(multiple dynode),MALDI离子源,正离子模式固定聚焦337 nm,激光束能频75～80 Hz,收集范围m/z 2 000～20 000 u,每样品收集200次峰叠加,校准品为ATCC 8739大肠杆菌。

数据分析：收集质谱图谱导入MALDI SARAMIS微生物鉴定系统中指纹数据库与数据库的标准谱图进行多重比较,采用SARAMIS Premium软件中的Superpectrum和Taxonomy的进行标记峰足迹图绘制、标识峰整理与微生物聚类分析。

2 结果与分析

2.1 铜绿假单胞菌和黏质沙雷氏菌的分离与鉴定

在50个草莓样品中9份样品分离到铜绿假单胞菌,检出率为18%;10份样品中检测出黏质沙雷氏菌,检出率20%。生化鉴定结果见表1,质谱见图1,质谱鉴定结果与生化鉴定结果一致,可以验证质谱鉴定准确性。实验结果显示铜绿假单胞菌和黏质沙雷氏菌在草莓中检出率较高,且检出结果仅与草莓成熟程度有关,与样品取样地点无关,表明这两种条件致病菌是草莓表面的常见微生物。

2.2 铜绿假单胞菌的MALDI-TOF MS相关分析

9份草莓中分离的铜绿假单胞菌的质谱足迹图显示小分子量区域的标识峰较密集,随着分子量增大,识别标识峰逐渐减少。分离的铜绿假单胞菌足迹图表明,鉴定同为一种菌,同种处理方法下标识峰数目和轨迹仍差异较大。对9份铜绿假单胞菌的所有标识峰进行拟合运算,mi(1±0.08%)内被认定为同个标识峰,铜绿假单胞菌共有标识峰12组见图2,认定为草莓铜绿假单胞菌的特征标识峰。

表1 铜绿假单胞菌和黏质沙雷氏菌生化鉴定结果Tab.1 Biochemistry map of Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens in strawberry

图1 微生物鉴定质谱Fig.1 Microorganism masspectrum of MALDI-TOF MS

对分离的铜绿假单胞菌标识峰进行聚类分析,分析图谱见图3a,以标识峰为测量点在用马氏算法计算微生物之间的距离时,默认权重Wi(i=1,2,3…p),为标识峰分子量的倒数,对12组特征峰进权重W乘以自然常数e以增加权重,重新计算聚类分析图谱见图3b,由图可以看出对特征峰进行加权后样品间的相关位置有一定变化,相关系数有所提高,但一级分支位置基本没变,4号和9号相关系数最高,表明两株铜绿假单胞菌种间差异小,经调查2份样品来自基地,且基地位置毗邻。

图2 铜绿假单胞菌特征标识峰质谱Fig.2 Pseudomonas aeruginosa characteristic peaks of MALDI-TOF MSmass spectrum

图3 铜绿假单胞菌MALDI-TOF MS聚类分析Fig.3 Pseudomonas aeruginosa cluster dendrogram by MALDI-TOF MS

2.3 黏质沙雷氏菌的MALDI-TOF MS相关分析

图4 黏质沙雷氏菌特征标识峰质谱Fig.4 Serratia marcescens characteristic peaks of MALDI-TOF MS

草莓分离的黏质沙雷氏菌的质谱图见图1b,对分离10份样品黏质沙雷氏菌进行全标识峰拟合运算,同株标识峰范围为mi(1±0.08%),10株黏质沙雷氏菌共有8组完全拟合的特征峰(见图4),对分离的10株黏质沙雷氏菌进行全标识峰进行聚类分析,见图5a,其中5号和10号、6号和9号、1号和8号黏质沙雷氏菌在一级分支中,但其相关系数均小于60%,对特征峰进行加权后重新聚类,见图5b,聚类结果可见一级分支中6号和2号黏质沙雷氏菌的相关位置发生改变,且相关系数提高到大于90%,其余一级分支的相关系数也有提高,经溯源6号和2号分离草莓来自同一市场不同摊位,1号和8号分离草莓样品为毗邻基地样品。可见MALDI-TOF MS可以用来微生物的溯源和种间特征性分析,但若提高其准确性,还需要进一步优化数据库。

图5 黏质沙雷氏菌聚类分析树状图Fig.5 Serratia marcescens cluster dendrogram by MALDI-TOF MS

3 结 论

草莓中微生物群落较多样[16-17],铜绿假单胞菌分离方法的设计是根据铜绿假单胞菌42℃可以生长的特点,其中连四硫磺酸阴离子可抑制大肠菌群,且显色培养基可以分辨铜绿假单胞菌,该分离方法对草莓中铜绿假单胞菌有较好的分离效果;黏质沙雷氏菌分离方法设计是根据沙雷氏菌对营养要求低,可以在水中生存营养琼脂培养基上产色素的特点设计,实验中分离多种沙雷氏菌,经质谱鉴定黏质沙雷氏菌的检出率最高。

MALDI-TOF MS对草莓中纯化的微生物有很好的识别率,经生化试验验证,鉴定完全一致,但质谱图谱给予微生物蛋白质的信息量较高,可用于溯源分析等相关应用,但提高其准确性还需要进一步优化数据库。MALDI-TOF MS为开放平台,可对于农产品中复杂且有一定特性的微生物种类进行记录,寻找其中特征性规律,便于对农产品微生物进行监测和研究。