利用小麦胚芽制备GABA

季妮娜,姚鑫淼,*,管立军,卢淑雯,高 扬,张英蕾,沈卉芳,王家有,张莉莉

(1.黑龙江省农业科学院食品加工研究所,黑龙江哈尔滨 150086;2.黑龙江省农业科学院农化研究所,黑龙江哈尔滨 150086;3.黑龙江省农业科学院浆果研究所,黑龙江绥棱 152200)

γ-氨基丁酸(GABA)是一种非蛋白质氨基酸,在哺乳动物和昆虫的神经系统中作为重要的抑制性神经递质存在,此外还存在于细菌、真菌、藻类、蕨类和一些高等植物当中。高等植物组织中GABA的含量超过许多蛋白质类氨基酸的含量,达到0.3～32.5 μmol·g-1[1]。研究表明,在人脑能量代谢过程中GABA起到了十分重要的作用,它具有激活脑内葡萄糖代谢、促进乙酰胆碱合成、降血氨、抗惊厥、降血压、改善脑机能、精神安定、促进生长激素分泌等生理作用,特别是在降血压方面的作用[2]。因此大量GABA的强化保健食品应运而生,如含有GABA的茶及口服液等产品。由于GABA在动植物原料中含量很低,很难从这些天然组织中大量提取到,目前GABA的制备主要分为化学法和生物法两大类,其中生物法又包括微生物发酵法和植物制备法[3]。化学方法合成GABA的工艺中使用的原料毒性大、价格昂贵、反应条件苛刻、安全性较差和产物中有害物质残留严重等,不宜作为食品及饲料添加剂使用。而微生物发酵法具有操作条件温和、成本低等特点,但需要人员多、发酵周期长、工业化难度较大。因此本研究采用植物制备法,成本低,安全可靠,工艺简单易控制[4]。

小麦胚芽是小麦制粉的副产物,富含多种营养成分,且价格低廉[5]。因此本实验以小麦胚芽及谷氨酸为原料,进行GABA工艺的优化实验。实验的主要原理是利用小麦胚芽中的谷氨酸脱羧酶与谷氨酸在吡哆素辅酶的催化下反应生成高品质、高浓度的GABA溶液。本研究的目的是开发出可以在食品中应用的GABA,绝不是利用药用GABA的简单添加,而是要从制备这个源头开始,利用天然物质及采用生物技术方法,生产出可安全用于食品并可被视为天然添加剂的食用GABA。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦胚芽 山东省枣庄市农家自产,置于-30 ℃冰箱保存;吡哆素 纯度>99%,湖南世纪华星生物工程有限公司生产;纯度为99%的食品级L-谷氨酸 无锡必康生物工程有限公司生产。

SHHW21.600AII型恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;XS204型电子天平 Mettler Toledo分析仪器制造有限公司;UltiMate 3000液相色谱仪 美国赛默飞世尔公司;离心机 SIGMA公司;QT-1旋涡混合器 上海琪特分析仪器有限公司;XS204分析天平(0.0001 g) 梅特勒-托利。

1.2 实验方法

1.2.1 GABA的制备方法 分别称取谷氨酸、小麦胚芽、吡哆素,再加入蒸馏水,将反应液放入水浴锅中加热,用电动搅拌器进行搅拌,由于反应过程中会消耗部分吡多素,因此反应每隔1 h后追加100 mg的吡哆素[1]。反应过程中利用缓冲液控制反应液的pH为6,结束后5000 r/min,离心10 min后取上清液。

1.2.2 GABA生成量的测定 采用高效液相色谱法(HPLC)[6-10]。

HPLC色谱条件如下:色谱柱采用C18柱,250 mm×4.6 mm,5 μm;紫外检测器,检测波长436 nm;柱温30 ℃;进样量10 μL。流动相采用乙腈与三水合乙酸钠混合溶液(v:v=35%:65%),流速1.0 mL/min。

样品衍生化:准确吸取1 mL试样溶液或标准工作溶液于具塞试管中,加入0.20 mL浓度为0.04 g/mL的碳酸氢钠溶液和0.4 mL浓度为3 mg/mL的4-二甲基氨基偶氮苯-4-磺酰氯衍生试剂,混匀后在70 ℃水浴中衍生反应20 min,用微孔滤膜过滤,待测。

GABA标准曲线制作:精确称取GABA标准品10 mg,用乙腈溶液溶解并定容至10 mL,即为1000 mg/L的标准储备液。在使用中将标准贮备溶液逐级稀释成2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg/L。以浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。得到曲线方程y=735.5713x+158.2493(R2=0.9993)。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 谷氨酸添加量对GABA生成量的影响 取250 g小麦胚芽,添加100 mg吡哆素,在反应温度40 ℃、pH在5.0的条件下反应4 h。考察谷氨酸添加量60、80、100、120、140 g/L对GABA生成量的影响。

1.2.3.2 反应时间对GABA生成量的影响 取250 g小麦胚芽,添加100 mg吡哆素,在谷氨酸添加量为60 g/L、反应温度40 ℃、pH在5.0的条件下考察反应时间1、2、3、4、5、6、7 h对GABA生成量的影响。

1.2.3.3 反应液的pH对GABA生成量的影响 取250 g小麦胚芽,添加100 mg吡哆素,在谷氨酸添加量为60 g/L、反应温度40 ℃的条件下反应4 h,考察反应液的pH4.0、4.5、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.5、7.0时GABA的生成量。

1.2.3.4 GABA制备温度对生成量的影响 取250 g小麦胚芽,添加100 mg吡哆素,在谷氨酸添加量为60、80、100、120、140 g/L pH在5.0的条件下反应4 h,考察反应温度30～50 ℃对GABA生成量的影响。

1.2.4 中心组合实验 采用中心组合设计(CCD)响应面法(RSM)优化小麦胚芽制备GABA的条件。在单因素实验基础上,对影响GABA生成量的四个因素即谷氨酸添加量、反应时间、反应液pH、反应温度进行优化[12-13]。

表1 响应面实验水平设计Table 1 Factors and levels in the response surface analysis

1.3 数据处理

实验过程中,每组实验重复3次,采用SPSS 17.0软件进行数据的显著性分析,应用Origin 7.0软件作图[11]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 谷氨酸添加量对GABA生成量的影响 由图1可以看出,GABA的生成量随谷氨酸的添加量的增加先上升后下降,在添加量为100 g时,GABA的生成量达到峰值。而添加量大于100 g时,GABA的生成量随谷氨酸添加量的增加而降低。且添加量为100 g时,GABA的生成量达到33.9 mg/L,但随着添加量的不断增多反应液会出现小麦蛋白深层发酵产生的不愉快的气味[12,16],在反应液搜集时不愉快的气味也没有消失。因此在考虑到原料的利用率及反应液的安全性上[13],谷氨酸的添加量为100 g时得到最大的生成量,能充分地利用谷氨酸产生大量的GABA。

图1 谷氨酸添加量对GABA生成量影响Fig.1 Effect of the amount of glutamic acid added on production of GABA

2.1.2 反应时间对GABA生成量的影响 由图2可以看出随着反应时间的延长,GABA生成量快速增加;在反应4 h以后GABA的生成量增加趋于平缓。继续延长反应时间,GABA的生成量增加趋于平缓。这可能是因为GABA的大量制备影响了谷氨酸与谷氨酸脱羧酶在吡哆素催化下的反应[15]。但是当反应时间超过4 h后,由于杂菌的作用使反应液颜色变深并会发出不愉快的气味[18]。作为制作食品的原料,反应时间超过4 h的反应液并不适合加入到食品中去,所以得出适宜的反应时间为4 h。

图2 反应时间对GABA生成量的影响Fig.2 Effect of reaction time on production of GABA

2.1.3 反应液的pH对GABA生成量的影响 从图3中可以看出GABA的生成量随pH的变化呈现为先上升后下降的趋势。当pH为5.8时生成量达到峰值。分析此变化的原因应该是,谷氨酸脱羧酶活性随着pH的增大而增强[17],达到适宜pH时活性最强。超过了最适pH时,谷氨酸脱羧酶活性与pH成反比,随着pH的增大而减弱,因此可以确定反映的适宜pH为5.8。

图3 pH对GABA生成量的影响Fig.3 Effect of pH on production of GABA

2.1.4 反应液的温度对GABA生成量的影响 从图4中可以看出,GABA的生成量随着反应温度的升高呈现先升高后降低的趋势,且在温度为40 ℃时达到峰值。这说明谷氨酸脱羧酶的适宜温度在40 ℃。在40 ℃之前,谷氨酸脱羧酶的活性随着温度的升高而增强[18]。尤其在35～40 ℃之间,谷氨酸脱羧酶的活性随温度的上升而快速增强。当温度超过40 ℃时,谷氨酸脱羧酶活性明显降低,所以由此可以确定谷氨酸脱羧酶适宜温度为40 ℃。

图4 温度对GABA生成量的影响Fig.4 Effect of temperature on production of GABA

2.2 小麦胚芽制备GABA的响应面实验

2.2.1 预测模型建立 响应面实验设计方案及结果见表2。

表2 小麦胚芽制备GABA中心组合实验方案及结果Table 2 Central composite design matrix of enriched GABA use

根据表2的实验结果,建立GABA生成量的二次响应回归模型为:

对实验模型进行方差分析,结果见表3。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Variance analysis for regression equation

图5 谷氨酸添加量与pH响应面及等高线图Fig.5 Response surface and contour of the interaction with the amount of glutamic acid added and pH

图6 谷氨酸添加量与反应温度响应面及等高线图Fig.6 Response surface and contour of the interaction with the amount of glutamic acid added and temperature

图7 谷氨酸添加量与反应时间响应面及等高线图Fig.7 Response surface and contour of the interaction with the amount of glutamic acid added and reaction time

图8 pH与反应温度响应面及等等高线图Fig.8 Response surface and contour of the interaction with the temperature and pH

图9 pH与反应时间响应面及等高线图Fig.9 Response surface and contour of the interaction with reaction time and pH

图10 反应温度与反应时间响应面及等高线图Fig.10 Response surface and contour of the interaction with reaction time and temperature

2.2.3 最佳工艺的确定及验证性实验 根据上述实验所得的结果和二次多项回归方程,利用Designexpert软件获得了小麦胚芽制备GABA生成量最高时的工艺条件为谷氨酸的添加量为80 g,pH维持在5.6并在40 ℃下反应4 h,预测计算得到的GABA的生成量为36.12 mg/L。为了验证其优化结果的可靠性,在最佳工艺条件下进行5组平行实验,测得GABA生成量分别为平均值为(35.42±2.19) mg/L,由回归方程预测所得到GABA最高生成量与验证实验测得的平均值相接近,说明该模型能够较好地预测GABA生成量。

3 结论

本实验以谷氨酸添加量、反应时间、反应液pH、反应温度为自变量,生成GABA的量为响应值,通过SPS 9.1软件,运用响应面实验设计对实验结果进行分析,得到了回归模型与实验结果能够较好的拟合,自变量与响应值之间线性关系较为显著,有一定的应用价值。优化验证后得到的最优工艺参数为向250 g新鲜的小麦胚芽中添加谷氨酸的量为80 g/L,反应液的pH为5.6,反应温度为40 ℃,持续反应4 h,所能得到GABA的生成量为(35.42±2.19) mg/L。由于此反应是食物来源生成的GABA较工业化学合成的安全可靠,且作为原料的小麦胚芽价格低廉,可将生成的GABA作为添加剂添加到食品中。