鱼胶原蛋白肽对α乳白蛋白和表没食子儿茶素没食子酸酯聚集行为的影响及所形成三元复合物的热稳定性

杨 伟,陈如炎,徐 响,赵 通,李 根,郝一博,王文娟,焦梦婷,张 浩,李 波,*

(1.河南科技学院食品学院,河南新乡 453003;2.中国农业科学院蜜蜂研究所,北京 100093)

鱼胶原蛋白肽(CP)分子量小,具有较高的营养价值和生物活性,能够100%被人体吸收利用,常用于功能性食品、饮料和化妆品中[1]。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中的主要活性成分,具有优良的抗菌性和抗氧化活性,被广泛用作功能食品添加剂,作为药品或保健品应用于减肥、慢性疾病和亚健康人群中[2-6]。多酚能够与蛋白质和多肽通过非共价键(氢键、疏水作用和范德华力等)结合,在一定条件下聚集形成可逆的亚微米复合物[7-8]。这类亚微米复合物一般浊度较大,常被认为是影响葡萄酒、啤酒、黄酒等酒类产品以及茶饮料和果蔬汁饮料感官品质的主要原因[9-12]。

许多因素能够干扰蛋白质-多酚亚微米复合物的形成[13]。研究表明,果胶、黄原胶和阿拉伯胶等阴离子多糖能够影响蛋白质和多酚的聚集,其主要机制是在溶液中形成以蛋白质-多酚复合物为核,多糖为壳的“蛋白质-多酚-多糖三者复合物”,通过增加复合物的水溶性而抑制蛋白质-多酚聚集体的形成[14-15]。最新研究表明,除了阴离子多糖外,一些分子量较小的食品功能性因子,如CP,也能够抑制蛋白质-多酚复合物的形成[16]。Yang等[16]采用三种自组装顺序,研究了CP对乳铁蛋白(LF)和EGCG所形成浊度的抑制作用,研究发现,CP能够与吸附在LF表面的EGCG发生竞争,通过形成粒径较小的LF-EGCG-CP三元复合物而使溶液浊度降低,但LF结构没有发生显著变化。α-乳白蛋白(α-La)是一类重要的乳蛋白,作为壁材,能够包埋、运载、传递EGCG[17]。但在一定条件下,α-La能够与EGCG形成混浊沉淀,进而限制了α-La-EGCG复合物在澄清溶液中的应用。热处理是许多食品加工中重要的步骤,CP对蛋白质与多酚聚集行为的影响可能受环境因素,尤其热加工处理的影响。

本文通过测定α-La-EGCG-CP三元复合物的浊度、粒径、电位、荧光光谱和圆二色谱,在室温(25 ℃)条件下研究CP对α-La与EGCG聚集行为的影响,并在70 ℃条件下对所形成的三元复合物体系进行热处理,研究α-La-EGCG-CP三元复合物聚集体结构的热稳定性,为解决α-La-EGCG复合物在澄清溶液中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱼胶原蛋白肽(CP) 纯度≥99%,来源于罗非鱼鱼皮,平均分子量2000 Da,北京盛美诺生物技术有限公司;α-乳白蛋白(α-La) 纯度≥95%,美国Agropur公司;表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) 纯度≥98%,美国Sigma公司;其它所用化学药品 均为分析纯。

2100N型浊度计 美国HACH公司;Zetasizer Nano-ZS型激光粒度仪 英国Malvern公司;Cary-Eclipse型荧光分光光度计 美国安捷伦公司;Pistar π-180型圆二色谱 英国应用光物理公司。

1.2 实验方法

1.2.1α-La-EGCG-CP三元复合物的制备 在10 mmol/L柠檬酸盐缓冲溶液(pH=3.0)中,分别配制0.6 mmol/Lα-La和5.0 mmol/L的EGCG母液。按三种不同的添加顺序制备α-La-EGCG-CP三元复合物，室温为25 ℃。

处理组1:取2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液和1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液,利用涡旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均匀,静置2 h后加入1.0 mL浓度分别为15、22.5、30、45、60、75 mg/mL的CP溶液,继续混合1 min后静置2 h。制备的三元复合物记为SATx-1(x=25和70 ℃),SAT25 ℃-1和SAT70 ℃-1分别表示采用第一种添加顺序制备的室温自组装三元复合物和70 ℃条件下热处理三元复合物。

处理组2:取2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液和1.0 mL浓度分别为15、22.5、30、45、60、75 mg/mL的CP溶液,利用涡旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均匀,静置2 h后加入1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液,继续混合1 min后静置2 h。制备的三元复合物记为SATx-2(x=25和70 ℃),SAT25 ℃-2和SAT70 ℃-2分别表示采用第二种添加顺序制备的室温自组装三元复合物和70 ℃条件下热处理三元复合物。

处理组3:取1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液和1.0 mL浓度分别为15、22.5、30、45、60、75 mg/mL的CP溶液,利用涡旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均匀,静置2 h后加入2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液继续混合1 min后静置2 h。制备的三元复合物记为SATx-3(x=25和70 ℃),SAT25 ℃-3和SAT70 ℃-3分别表示采用第三种添加顺序制备的室温自组装三元复合物和70 ℃条件下热处理三元复合物。

空白对照组:取2.0 mL 0.6 mmol/L的α-La溶液和1.0 mL 5.0 mmol/L的EGCG溶液,利用涡旋混合器混合(3000 r/min,1 min)均匀,静置2 h后加入1.0 mL缓冲溶液,继续混合1 min后静置2 h。

α-Lax(x=25和70 ℃)分别表示在室温条件和70 ℃加热条件下的α-La溶液。

1.2.2 浊度测定 采用2100 N浊度仪测定样品的浊度。测定温度为25 ℃。浊度仪采用90°散射光原理,在恒定入射光条件下,散射光强度与溶液的浑浊度成正比。

1.2.3 粒径和zeta电位(ζ-电位)测定 采用Zetasizer Nano-ZS激光粒度仪室温分析三元复合物的粒径大小和ζ-电位,同时用多分散系数(Polydispersity Index,PdI)表示粒径分布。

1.2.4 荧光光谱测定 采用Cary-Eclipse荧光分光光度计进行荧光光谱扫描,其中激发波长为292 nm,激发缝宽和发射缝宽均为10 nm,记录荧光强度的变化。

1.2.5 圆二色谱测定 采用Pistar π-180型圆二色谱仪测定三元复合物中α-La的二级结构。取0.4 mLα-La浓度为0.02 mg/mL的样品于样品池中,样品池的光径为0.1 cm,扫描波长范围为190～260 nm,温度为25 ℃,扫描速度为100 nm/min,累计次数3次,记录CD图谱。同样实验条件下测定柠檬酸盐缓冲溶液的圆二色谱为空白。根据DICHROWEB的方法计算二级结构的百分含量[18-20]。

1.3 数据分析

每组实验至少重复两次,每个样品至少检测三组数据,结果用平均值M±标准差SD来表示。运用SPSS 18.0软件,采用Duncan法对数据进行单因素方差分析,显著水平为5%。

2 结果与分析

2.1 CP浓度对三元复合物浊度的影响

在10 mmol/L pH3.0柠檬酸盐缓冲液中,当EGCG浓度为1.25 mmol/L 时,α-La-EGCG复合物的浊度为(604±30) NTU。经70 ℃热处理后,α-La-EGCG复合物的浊度为(1900±50)NTU,较之25 ℃条件下增加3.15倍左右,这可能与α-La-EGCG复合物的热聚集有关。

如图1a所示,采用三种添加顺序制备的α-La-EGCG-CP三元复合物,它们浊度随CP浓度的增加表现出相似的变化规律,即先增大后减小。当CP浓度为15～30 mg/mL时,SAT25 ℃-1浊度略有增加,而SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3浊度增加明显;当CP浓度为60和75 mg/mL时,SAT25 ℃-1的浊度分别减小了46.5%和76.8%,SAT25 ℃-2的浊度分别减小了32.1%和56.5%,SAT25 ℃-3的浊度分别减小了42.1%和70.7%。换句话说,利用三种添加顺序制备的α-La-EGCG-CP三元复合物中,当CP浓度较低时,CP能够促进不溶性沉淀的形成,而当CP浓度较高时,CP能够较好的抑制α-La与EGCG不溶性沉淀的形成,使溶液浊度降低,且处理组1最有效。低浓度的CP会增加溶液中不溶性聚集物的形成可能是由于CP能够吸附在LF-EGCG复合物表面,从而使复合物的粒径增加,但由于含量较少,不足以溶解复合物,因此,溶液浊度增加。Yang等[16]研究发现,添加CP并没有使LF和EGCG形成的不溶性聚集物浊度增加,这可能是本文所用的原料和溶液环境与其不同有关。处理组1、处理组2和处理组3制备的溶液浊度随CP的添加所表现出的不同增强或降低浊度的能力,说明溶液的浊度与α-La、EGCG和CP的添加顺序有直接关系。

图1 CP浓度对SAT25 ℃(a)和SAT70 ℃(b)浊度的影响Fig.1 Influence of CP concentration on the turbidity of SAT25 ℃(a)and SAT70 ℃(b)

SAT70 ℃浊度表现出与SAT25 ℃不同的变化规律:在CP浓度为15 mg/mL时,SAT70 ℃浊度较之SAT25 ℃高;在CP浓度为22.5 mg/mL时,SAT70 ℃浊度与SAT25 ℃差异不明显;在CP浓度较高(≥30 mg/mL)时,SAT70 ℃浊度较之SAT25 ℃低;同时,SAT70 ℃-1、SAT70 ℃-2和SAT70 ℃-3具有相同的变化规律,均随CP浓度的增加而减小,且三种处理组所得溶液浊度差异性不明显(图1b)。这可能是因为:通过三种添加顺序制备的SAT25 ℃因热的作用(70 ℃,20 min)重新组装,进而形成结构相同且均一的α-La-EGCG-CP三元复合物。

总之,较高CP浓度条件下,三种处理组制备的SAT25 ℃溶液浊度较小,溶液中α-La-EGCG复合物形成的浊度受到了抑制;处理组1最有效,其次是处理组3和处理组2。热处理能够增加α-La-EGCG-CP三元复合物的溶解性。

2.2 CP浓度对三元复合物粒径的影响

图2为CP浓度对α-La-EGCG复合物的粒径和粒径分布的影响。从图2可以看出,随着CP浓度的增加,SAT25 ℃和SAT70 ℃平均粒径变化规律与浊度基本一致。

图2 CP浓度对SAT25 ℃(a)和SAT70 ℃(b)粒径和PDI的影响Fig.2 Influence of CP concentration on the particle size and PDI of SAT25 ℃(a)and SAT70 ℃(b)

对于SAT25 ℃,当CP浓度较低(≤ 45 mg/mL)时,由于CP主要吸附在α-La-EGCG复合物表面,CP的浓度不足以抑制聚集物的形成,因此α-La-EGCG-CP三元复合物粒径变大,且PDI较大;当CP浓度为75 mg/mL时,SAT25 ℃的粒径变小(SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3分别为(543±78),(506±12)和(954±90) nm,且PDI较小(SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3的PDI由0.419分别降至0.017、0.12和0.035),表明溶液中的α-La-EGCG-CP三元复合物分布变得均一。

对于SAT70 ℃,SAT70 ℃的粒径随CP浓度的增加而减小。但与SAT25 ℃相比,SAT70 ℃的粒径较大,推测可能与α-La、α-La-EGCG复合物或α-La-EGCG-CP三元复合物的热聚集有关。同时,SAT70 ℃-1、SAT70 ℃-2和SAT70 ℃-3的PDI由0.996分别降至0.233、0.182和0.126,表明热处理使溶液中三元复合物的分布变得均匀。

2.3 CP浓度对三元复合物ζ-电位的影响

ζ-电位是衡量水溶液中复合物稳定性的重要指标。图3为SAT25 ℃和SAT70 ℃随CP浓度的增加ζ-电位的变化情况,从中可得,随着CP浓度的增加,三元复合物溶液的ζ-电位减小,当CP浓度大于45 mg/mL时,三元复合物溶液的ζ-电位接近于0。这与Yang等[16]的相关研究结果不同,这主要与CP所带电荷不同有关。应当指出的是,尽管溶液的ζ-电位随着CP浓度的增加而减小,但溶液的浊度减小,稳定性增强,这可能与CP抑制蛋白质-多酚聚集体形成的机理有关。Yang等[16]认为,CP能够抑制LF-EGCG聚集体的形成,主要是因为CP能够通过竞争作用和空间位阻干扰LF与EGCG的结合[16]。因此推测,高浓度CP条件下,SAT25 ℃和SAT70 ℃浊度较低但稳定性较高的主要原因可能与CP的竞争作用,尤其是空间位阻作用有关。

图3 CP浓度对SAT25 ℃(a)和SAT70 ℃(b)ζ-电位的影响Fig.3 Influence of CP concentration on the ζ-potential of SAT25 ℃(a)and SAT70 ℃(b)

2.4 CP浓度对三元复合物荧光强度的影响

α-La分子含有4个色氨酸残基[21]。如果基团在天然蛋白质的内部,色氨酸峰值可能发生蓝移;如果蛋白分子舒展,色氨酸峰值可能发生红移[22]。通过监测色氨酸发射峰的变化,可以获取相关的蛋白结构变化和荧光团周围微环境的变化。

图4a～图4c为SAT25 ℃随着CP浓度的增加荧光光谱变化。随着CP浓度的增加,SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3均发生明显的荧光淬灭,荧光强度由100%分别降至22.5%、24.6%和23.2%;同时,CP使三元复合物的发射峰发生红移,分别由361 nm移至376、373和374 nm。这说明α-La与CP之间存在较强的结合能力,CP的加入显著改变了α-La的结构,α-La分子中色氨酸残基的微环境发生了显著变化。因此推测,对于SAT25 ℃,CP与α-La-EGCG之间的相互作用导致α-La结构更加伸展,α-La分子中色氨酸的亲水性增强。

图4 CP浓度对SAT25 ℃和SAT70 ℃的荧光强度(a～f)和荧光强度变化率(g)的影响Fig.4 Influence of CP concentration on the fluorescence intensity (a～f) and fluorescence intensity change rate(g)of SAT25 ℃ and SAT70 ℃

图4d～f为SAT70 ℃随着CP浓度增加的荧光光谱变化。α-La-EGCG复合物在70 ℃热处理较之25 ℃条件下,荧光强度增强,且发生了显著的蓝移,这与热处理使α-La分子热变性,结构更加伸展、疏水性增强有关。随着CP浓度的增加,SAT70 ℃的荧光光谱变化规律与SAT25 ℃相似,即荧光强度明显降低,发射峰红移(图4g)。值的注意的是,SAT70 ℃的荧光淬灭程度较之SAT25 ℃明显。例如,当CP浓度为75 mg/mL时,SAT70 ℃-1、SAT70 ℃-2和SAT70 ℃-3荧光强度较α-La-EGCG复合物的荧光强度分别降低12.3%、13.4%和12.0%,而SAT25 ℃-1、SAT25 ℃-2和SAT25 ℃-3荧光强度较α-La-EGCG复合物的荧光强度分别降低22.5%、24.6%和23.2%,说明CP在SAT70 ℃中较之在SAT25 ℃中更加接近α-La。因此推测,对于SAT70 ℃,虽然热处理使α-La-EGCG复合物疏水性增强,但当加入CP后,CP与α-La-EGCG之间的相互作用同样导致α-La结构更加伸展,α-La分子中色氨酸的亲水性进一步增强。

2.5 CP浓度对三元复合物中α-La二级结构的影响

为获取更多CP引起α-La二级结构变化的信息,采用远紫外圆二色谱对复合物进行分析。如图5a所示,在190～260 nm波长范围内,α-La-EGCG复合物的圆二色谱在208～210 nm处具有较宽的峰,在218～220 nm处具有肩峰。采用DICHROWEB测定α-La二级结构的含量。α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲通过CDSSTR进行测定,结果如图5b所示。

图5 α-La-EGCG二元复合物和α-La-EGCG-CP三元复合物(EGCG含量为1.25 mmol/L)远紫外圆二色谱图(a)和二级结构含量(b)Fig.5 Far-UV circular dichroism spectra of α-La-EGCG binary complex and α-La-EGCG-CP ternary complex (EGCG content 1.25 mmol/L)(a) and secondary structure content(b)

在α-La-EGCG复合物(EGCG含量为1.25 mmol/L)中,α-La含有29%α-螺旋、20%β-折叠、22%β-转角和30%无规则卷曲。而在SAT25 ℃中,α-La含有较多的α-螺旋(42%),β-折叠、β-转角和无规则卷曲均减小,这可能与CP与α-La的结合有关。CP的添加引起了α-La二级结构的改变。该结果与荧光光谱结果一致。

SAT70 ℃中α-La的结构与SAT25 ℃中的大致相同,仅β-折叠和β-转角减小1%,而无规卷曲含量增加2%。由此推之,热处理对α-La-EGCG-CP三元复合物中α-La的结构略有影响。

CP对α-La-EGCG聚集物可能的抑制机制是:当CP浓度较低时,不足以抑制α-La-EGCG聚集体的形成,而主要吸附在α-La-EGCG聚集物表面,因此复合物粒径较大,PDI较大;当CP浓度较高时,CP能够通过竞争作用或空间位阻破坏EGCG对α-La的桥联作用,从而形成粒径和粒径分布较小的三元复合物。热处理能够使复合物(α-La-EGCG复合物和/或α-La-EGCG-CP复合物)中的α-La变性聚集,进而使复合物的粒径增大。

3 结论

当CP浓度较低时,主要通过吸附机制形成粒径较大的不溶性α-La-EGCG-CP三元复合物,而当CP浓度较高时,主要通过竞争机制或空间位阻效应,形成粒径较小的α-La-EGCG-CP三元复合物。CP对复合物粒径和浊度的影响取决于α-La、EGCG和CP的添加顺序。热处理能够进一步减小α-La-EGCG-CP三元复合物的浊度。总之,CP干扰α-La与EGCG聚集的能力及所形成三元复合物的热稳定性,能够为α-La-EGCG复合物在澄清溶液中的应用提供理论基础。