乌贼墨黑色素的制备及体内外铅吸附效果研究

张朝阳,陈小娥,2,*,夏朝盛,马闻曜,陈柔含,郭 健,余 辉,2,员立萍

(1.浙江海洋大学食品与医药学院,浙江舟山 316022;2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室,浙江舟山 316022;3.陕西好时鲜海洋生物科技有限公司,陕西西安 710000)

乌贼是我国主要的头足类经济动物之一,其后腹侧直肠末端形成了发达的墨囊结构,内含大量乌贼墨。我国对乌贼墨的应用有着悠久的历史,很早就将其作为一种药材。近些年研究发现,乌贼墨是一种粘稠的混悬液,其主要活性成分为真黑色素和蛋白多糖复合体[1],有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、缓解脏器损伤[4]、抗菌[5]、免疫[6]、促进造血[7]等活性功能,但是在水产加工业发展的过程中,乌贼墨墨囊常以下脚料的形式丢弃,因而造成了资源的浪费。

我国铅超标问题较严重,大多来自工业污染,群体铅中毒事件时有发生[8],并且铅会损害多种细胞、组织和器官的相关功能[9],对机体的损害是全身性的[10]。有研究表明,乌贼墨中含有的黑色素是以吲哚结构为主体的异聚物[11],其结构中存在可与金属键结合的基团[12],可作为自由基的接受体而阻断自由基连锁反应[13],从而具有吸附铅等重金属离子的特性。

目前,国内已有学者对提取乌贼墨黑色素工艺进行了研究,主要有:高速离心水洗法[14]、浓盐酸酸洗法[15]和酶解法[16]。关于乌贼墨黑色素对铅的吸附作用,为了研究这3种方法所制备的乌贼墨黑色素对吸附铅性能的影响,以铅吸附量为指标,确定黑色素制备方法。在此基础上,通过扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)分析、红外光谱(Fourier transform-infrared spectroscopy,FT-IR)扫描将最佳者与粗提物的微观结构和功能基团进行初步探讨。建立铅中毒小鼠模型,对比低、中、高三种剂量的体外铅吸附量最佳乌贼墨黑色素与药物二巯基丁二酸(DMSA)[17]在小鼠肝脏和血中铅的吸附能力,以期为乌贼墨黑色素高值化利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乌贼墨囊(约25 g/个) 取自虎斑乌贼(Sepiapharaonis Ehrenberg),杭州好时鲜水产品有限公司;碱性蛋白酶(4200 U/g) 西安沃尔森生物技术有限公司;SPF级ICR小鼠 标准体重(20～24 g),雄性,浙江省医学科学院,生产许可证编号为SCXK(浙)2014-0001,饲养环境条件为屏障环境下,温度22～25 ℃,相对湿度55%～70%;基础饲料(蛋白质脂肪碳水化合物产热比为25.2∶11.9∶62.9)浙江省医学科学院;苏木精、伊红染液 上海研臣实业有限公司;二巯基丁二酸胶囊 上海新亚闵行药业有限公司;盐酸、氢氧化钠、硝酸、高氯酸等 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;醋酸铅 分析纯,上海化学试剂总厂。

GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;LGJ-10C型冷冻干燥机 成都苏净科学仪器有限公司;TDL-5-A型大功率低速离心机 上海安亭科学仪器厂;Varian AA204DUO 原子吸收光谱仪 美国Varian公司;TV-3100FTIR 6700漫反射原位傅立叶红外光谱分析仪 美国Thermo Scientific公司;日立S-3400N扫描电子显微镜 日本日立公司;ETHOS900 型微波消解系统 意大利Milestone 公司;CK40型光学显微镜 日本Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乌贼墨黑色素的制备

1.2.1.1 乌贼墨粗提物 经剪破的虎斑乌贼墨囊,挤压去表皮膜和内部网状膜,5000 r/min高速均质5 min后得到乌贼墨粗提物,置于4 ℃冰箱备用。

1.2.1.2 高速离心水洗法 参考Liu[14]等方法制备。将乌贼墨粗提物用等体积去离子水浸泡过夜后,1000 r/min离心10 min后得沉淀,加入沉淀质量50倍的去离子水,5000 r/min离心20 min,反复操作3次后,将沉淀进行冷冻干燥,设置真空室压力为10 Pa,冷阱温度-50 ℃,当干基含水率为(4±0.5) g/g时,干燥完成,即得水洗乌贼墨黑色素。将样品分装至真空密封袋中,4 ℃冰箱内避光保存。

1.2.1.3 浓盐酸水洗法 参考李兴旺等[15]方法制备。将乌贼墨粗提物用等体积去离子水浸泡过夜后,1000 r/min离心10 min,用0.2 mol/L的HCl洗涤,磁力搅拌10 min,5000 r/min离心20 min过滤;在浓盐酸的环境中,105 ℃下回流水解2 d,1000 r/min离心10 min后得沉淀,加入沉淀质量50倍的去离子水进行稀释,5000 r/min离心10 min,反复操作3次,加0.2 mol/L的NaOH调pH至中性,将沉淀冷冻干燥,即得酸洗乌贼墨黑色素,分装至真空密封袋中,4 ℃冰箱内避光保存。

1.2.1.4 碱性蛋白酶酶解法 参考李晓等[16]方法。将乌贼墨粗提物用等体积去离子水浸泡过夜后,1000 r/min离心10 min后得沉淀;向沉淀中加入沉淀质量50倍的去离子水,用0.2 mol/L的NaOH调节pH到10.5后加入4200 U/g的碱性蛋白酶,在50 ℃水浴中保温酶解4 h,然后灭酶,1000 r/min离心10 min得沉淀;将沉淀用去离子水洗至中性,冷冻干燥,即得碱性蛋白酶酶解乌贼墨黑色素,分装至真空密封袋中,4 ℃冰箱内避光保存。

1.2.1.5 乌贼墨黑色素得率计算 黑色素得率p按公式(1)计算。

式(1)

式中,m0为乌贼墨黑色素冷冻干燥后的质量(g);m为乌贼墨粗提物的质量(g)。

1.2.2 乌贼墨黑色素体外实验

1.2.2.1 乌贼墨黑色素体外吸附实验 配制质量浓度为800 mg/L的醋酸铅溶液,取50 mL于150 mL锥形瓶中,加入100 mg乌贼墨黑色素,以0.2 mol/L的 HCl溶液和0.2 mol/L的NaOH溶液调节pH至4.5,在25 ℃,150 r/min条件下恒温振荡3 h,反应后5000 r/min离心20 min,取滤液。按照GB5009.12-2010《食品中铅的测定》[18]测定滤液中铅含量,每组实验至少重复3次。铅的吸附量qt(mg/g)按式(2)计算。

式(2)

式中,V为溶液体积(L);C0为初始的重金属浓度(mg/L);C为吸附后的重金属浓度(mg/L);m为所用吸附剂的质量(g)。

1.2.2.2 乌贼墨黑色素扫描电镜(SEM)观测实验 将乌贼墨粗提物、铅吸附前后的乌贼墨黑色素使用扫描电子显微镜进行形态扫描[19],对扫描后的图片进行成像分析,观察它们的表面微观结构差异。

1.2.2.3 乌贼墨黑色素红外光谱(FT-IR)扫描实验 参考王君等[20]的方法,利用聚苯乙烯膜对傅里叶变换红外光谱仪进行红外波长校准后,将铅吸附前后的乌贼墨黑色素经冷冻干燥处理后,采用溴化钾(KBr)压片法,使用傅里叶变换红外光谱仪进行分析,波数为4000～400 cm-1。

1.2.3 乌贼墨黑色素体内吸附实验

1.2.3.1 小鼠分组及干预 将小鼠随机分成6组,每组12只,分别为:阴性对照组、醋酸铅模型组、药物对照组、实验低剂量组、中剂量组和高剂量组,在屏障环境中适应性喂养3 d。实验前各组小鼠均禁食不禁水 16 h。除阴性对照组饮用12.50 μL/L醋酸的去离子水外,其他各组均饮用1.00 g/L醋酸铅水溶液(加入12.5 μL/L醋酸酸化)[21]。4 w后,采用灌胃的方式对小鼠进行干预。实验组剂量为黑色素:50、100、200 mg/kg·d,阳性对照组为二巯基丁二酸(DMSA):100 mg/kg·d[22]。用去离子水溶解,按0.02 mL/g·bw给予。阴性对照组和醋酸铅模型组分别灌胃等体积的生理盐水,每日于上午9:00灌胃,持续8 w。

1.2.3.2 观察指标 实验期间,观察各组小鼠的中毒症状及死亡情况。分别于铅中毒4 w和灌胃8 w时,记录存活小鼠的体重,取小鼠股动脉采血,用带有分离胶的真空采集血管收集,颈椎脱臼处死,迅速解剖取出肝脏,肉眼观察肝脏并记录结果后,0.85%的生理盐水洗去血渍,吸水纸吸干表面水分后称重。肝脏系数按式(3)计算。

式(3)

式中:m1为肝脏湿重(g);m0为小鼠体质量(g)。

1.2.3.3 小鼠肝脏和血液铅含量的测定 根据GB 5009.12-2010《食品中铅的测定》[18],将小鼠的肝脏、血液均浆后,准确称取0.5 g左右,用硝酸-高氯酸(体积比4∶1)混合液10 mL进行微波湿式消化,结束后赶酸,将消化液冷却至室温,定容至25 mL,测定溶液中铅的含量。

1.2.3.4 苏木精-伊红(HE)染色法对小鼠肝脏细胞的观察 灌胃8 w后,取各组小鼠新鲜肝脏用10%福尔马林溶液固定,经酒精梯度脱水后,二甲苯硬化,石蜡包埋,硬化后切片。采用HE染色法染色,光学显微镜下观察肝脏的组织化学结构。

1.3 数据分析与处理

2 结果与分析

2.1 不同制备方法对乌贼墨黑色素铅吸附量和得率的影响

由表1,对比3种方法的铅吸附量可知,碱性蛋白酶酶解法的吸附效果最佳,达到(256.06±14.12) mg/g,高速水洗法的铅吸附量在(219.85±16.98) mg/g,与刘漫[23]研究结果非常接近。与高速水洗法相比,浓盐酸水洗法和碱性蛋白酶酶解法铅吸附量分别提高16.47%±2.85%以及13.85%±2.47%;与浓盐酸水洗法对比,碱性蛋白酶酶解法的提取乌贼墨黑色素的时间是前者的1/8,且酸法处理的乌贼墨黑色素废液中含有强酸,而碱性蛋白酶酶解法反应条件温和,并且对环境的污染较小。虽然酶解得率略低于水洗法,为16.7%,但工艺简单,并且对设备要求不高。因此,本实验确定以酶法制备的乌贼墨黑色素为下一步研究对象。

表1 乌贼墨黑色素的铅吸附量和得率Table 1 Lead adsorption capacity and yield of Sepia ink melanin

2.2 乌贼墨黑色素的SEM观测分析

通过采用SEM技术对乌贼墨粗提物、碱性蛋白酶酶解法制备的乌贼墨黑色素吸附铅前后超微结构进行观测,结果如图1～图3所示。由图1可知,乌贼墨粗提物中的黑色素是由单个的黑色素单体相互聚集、堆积而成,其表面光滑而清晰,表现为圆形的单体颗粒,与李和生的研究结果一致[24]。这些生物大分子是由小的低聚物分子组成[25]。碱性蛋白酶酶解法处理(图2)对乌贼墨黑色素的粒径减小和均匀性的提高产生了一定的作用。虽然吸附铅前后(图2、图3)的乌贼墨黑色素表面结构变化不明显,但对比后可发现,吸附后的黑色素较吸附前的颗粒表面光滑度下降。

图1 扫描电镜观测的粗提物超微结构(45000×)Fig.1 Ultra structure of Sepia ink melanin(45000×)

图3 酶解乌贼墨黑色素铅吸附后超微结构图(45000×)Fig.3 Ultra structure of enzymatic hydrolysis Sepia ink melanin after the adsorption of lead(45000×)

2.3 乌贼墨黑色素的FT-IR扫描分析

碱性蛋白酶酶解法制备的乌贼墨黑色素吸附铅前后FT-IR图谱如图4所示。图中乌贼墨黑色素出现的一系列强且宽的吸收峰,是黑色素表面不同的功能基团震动叠加形成的。

图4 乌贼墨黑色素铅吸附前后的红外光谱图Fig.4 FT-IR spectra of Sepia ink melanin before and after adsorption of lead

由表2可知，分析谱带的归属,发现酶法制备的乌贼墨黑色素表面具有:-OH、-NH、-COOH、C6H5-(苯基)、C8H6N-(吲哚)等多种功能基团[26]。吸收峰在1400 cm-1附近表示归属为真黑素的吲哚环[27],可以判断乌贼墨黑色素的功能基团中具有吲哚环结构,与李兴旺等[15]以及吕玲等[28]的研究基本一致。乌贼墨黑色素吸附铅后FT-IR图像出现多处位移,较为明显的有:吲哚和吡咯结构单元中的N-H和O-H的伸缩振动峰3391 cm-1移到3411 cm-1;-COOH的反对称伸缩峰1406 cm-1移到1372cm-1,说明-OH,-NH,-COOH是参与吸附重金属铅的主要功能基团。

表2 红外波数和对应的相关官能团Table 2 FT-IR absorption bands and corresponding functional groups

2.4 乌贼墨黑色素和铅对小鼠体质量的影响

体质量是反映机体发育是否正常的标志[29]。由表3可知,染铅4 w时,各实验组小鼠的体质量与实验初始各组小鼠相比,体质量在正常的增长范围内。经统计学分析,染铅4 w各组差异不显著(p>0.05)。灌胃8 w时,各组与染铅4 w的相比,体质量均在合理增长范围内,因而不具有统计学意义。说明在建立铅中毒小鼠模型和灌胃乌贼墨黑色素进行铅吸附期间,小鼠体质量变化与铅、乌贼墨黑色素相关性均不明显,并没有随着染铅以及灌胃时间的增加而发生显著变化,与孙相和等[30]的结果相似。

表3 乌贼墨黑色素对实验期间小鼠体质量变化影响Table 3 Effect of Sepia ink melanin on the weight of aged

2.5 小鼠肝脏系数的变化

表4可知,小鼠经过醋酸铅铅中毒建模4 w后,各组与阴性对照组相比肝脏系数差异显著(p<0.05)表明铅对肝脏的生长存在不良影响。灌胃8 w后,利用SPSS 18.0以及EXCEL 2010对各组小鼠肝脏系数进行统计,除醋酸铅模型对照外(p<0.05),其余不具有统计学的差异性(p>0.05)。

表4 小鼠肝脏系数Table 4 Weight and liver index of

2.6 铅中毒模型分析

铅中毒的模型有多种,有学者采用向小鼠腹腔注射醋酸铅水来建模,也有学者采用给小鼠投喂含有铅饲料的方法建模。本实验采用自由饮用醋酸铅溶液的方法,建立小鼠铅中毒模型。由表5知,染铅4 w后,各实验组小鼠肝脏与血液中的铅含量均显著高于阴性对照组(p<0.01),表明小鼠铅中毒模型构建成功。

表5 染铅4 w后各组小鼠组织中的铅含量Table 5 Lead content in mice tissues after 4 w of lead

2.7 乌贼墨黑色素对小鼠肝脏和血液的影响

表6可见,与醋酸铅模型组比较,各组小鼠肝脏和血中的铅含量均低于醋酸铅模型组,其中,低剂量差异显著(p<0.05),药物组,中、高剂量组差异极其显著(p<0.01)。中,高剂量肝脏与血液的铅含量分别下降17.18%±0.76%和31.09%±2.48%,20.85%±0.96%和34.45%±3.31%,两组间差异均不显著(p>0.05)。阳性对照组中血液与脏器中的铅含量与模型组相比均有极显著差异(p<0.01),铅含量下降明显,排铅效果比各剂量黑色素组明显。由此可知,中剂量和高剂量乌贼墨黑色素分别对铅中毒小鼠肝脏和血液有较好的排铅效果。

表6 灌胃8 w后各组小鼠的肝血中铅含量(n=6,x±s)Table 6 Effect of Sepia ink melanin on lead amounts of liver and blood of lead-treated mice after 8w(n=6,x±s)

2.8 乌贼墨黑色素对小鼠肝脏组织细胞的影响

实验期间,各醋酸铅模型组小鼠染铅18 d时出现精神沉郁,反应迟钝,行动缓慢,排尿量增大的情况,属于铅中毒现象。灌胃8 w后通过对小鼠肝脏进行HE染色以及病理组织分析如图5所示。由图5可知,阴性对照组肝脏细胞较为致密,而醋酸铅模型组肝脏细胞受损较为严重,组织结构疏松,存在断裂现象。灌胃8 w后,与醋酸铅模型组相比,各实验组小鼠的肝脏组织不同程度地恢复致密;与药物对照组相比,低剂量组肝脏组织致密程度较差,中剂量组与高剂量组对肝脏组织恢复较好,在组织致密程度和完整性上与阴性对照组相似。关于铅对机体的毒性作用机理研究,Saini等[31]发现铅在进入体内后会诱发自由基对机体造成氧化损伤,抑制体内的抗氧化物酶活性并加剧损害作用;任亚萍等[32]发现铅会引起大量肝细胞的水样变性,并在其中央静脉周围产生炎症细胞的堆积。

图5 小鼠肝脏切片观测(HE染色,100×)Fig.5 Mice hepatic by HE staining(100×)

3 结论

本实验对比了高速水洗、浓盐酸水洗以及碱性蛋白酶酶解三种处理方法制备所得乌贼墨黑色素的铅吸附效果,结果表明,碱性蛋白酶法制备的乌贼墨黑色素对体外铅吸附效果最好,吸附量达(256.06±14.12) mg/g,吸附率在80%以上。通过SEM微观结构和FT-IR扫描经一步的观察分析,发现经碱性蛋白酶法制备的乌贼墨黑色素颗粒均匀、表面粗糙,吸附反应发生在黑色素颗粒表层,-OH,-NH,-COOH是参与吸附重金属铅的主要功能基团。采用铅中毒小鼠模型,结果显示,乌贼墨黑色素对小鼠体重以及肝脏系数不存在显著性影响(p>0.05);对肝脏和血液中的铅有一定的吸附效果,中、高剂量组与模型组比较差异极为显著(p<0.01),对小鼠肝脏和血液的吸附率分别为17.18%±0.76%和31.09%±2.48%,20.85%±0.96%和34.45%±3.31%;HE染色法观察小鼠肝脏,发现黑色素对缓减肝脏细胞的受损存在一定作用。本论文的研究结果可为利用乌贼墨黑色素开发新型生物吸附材料提供理论依据。