一种胶原基质全层皮肤模型的构建和表征

宋肖洁 史晓婷 姚期凤 吴越

200233上海，伽蓝（集团）股份有限公司研发中心

三维皮肤模型是应用细胞生物学和工程学的技术和原理，在体外利用人正常皮肤细胞构建具有完整三维解剖结构、高度模拟人体皮肤的组织模型。组织工程技术的发展，以及制药业和化妆品行业对动物替代方法的巨大需求，推动了体外重建皮肤模型技术的进步。我们尝试使用来自中国人的皮肤细胞构建包含表皮-真皮结构的三维全层皮肤模型，并从形态学、超微结构以及特征蛋白表达方面对三维皮肤模型进行测试评估，以期将其应用于皮肤屏障、伤口愈合等皮肤相关的基础研究，以及和化妆品相关的安全性和功效性评估。

材料与方法

一、主要试剂及仪器

本研究通过上海芯超生物科技有限公司伦理委员会批准（YBM-05-02），健康人皮肤组织来自上海芯超·生物样本库。角质形成细胞无血清培养基（KSFM）、DMEM培养基（美国Invitrogen公司），猪胶原（北京金泰宏达生物科技有限公司），胎牛血清（美国Thermo公司），噻唑蓝（MTT）、曲拉通X-100（Triton X-100）（美国Sigma公司），OCT试剂（美国SAKURA公司）；一抗鼠抗人角蛋白10（K10）抗体、Ki67抗体、免疫组化试剂盒（丹麦Dako公司），鼠抗人转谷氨酰胺酶（TG）、原纤维蛋白抗体（fibrillin，美国Thermo公司），鼠抗人层黏连蛋白5抗体（laminin 5，美国Millipore公司），兔抗人Ⅲ型胶原抗体（COLⅢ，法国Novotec公司），鼠抗人Ⅳ型胶原（COLⅣ）（美国Santa Cruz公司）、Ⅰ型胶原（COLⅠ，英国Abcam公司）、丝聚合蛋白（filaggrin，美国Vector labs公司）抗体，二抗驴抗鼠Alexa Fluor®568、羊抗兔Alexa Fluor®568（美国Life technologies公司），荧光/化学发光酶标仪（美国PerkinElemer公司），普通/荧光显微镜（德国Zeiss公司）。

二、皮肤模型制备

1.原代皮肤细胞提取：人成纤维细胞及人角质形成细胞的提取参见文献［1］，将皮肤组织冲洗后置于含0.25%～0.5%分离酶的PBS溶液，4℃过夜；次日，分离真表皮，表皮部分使用0.5%胰酶室温消化15 min，无菌不锈钢滤网过滤后得到人角质形成细胞单细胞悬液，真皮部分使用含0.2%胶原酶的DMEM溶液于37℃消化2～6 h，过滤得到人成纤维细胞单细胞悬液，分别计数、传代培养或冻存。

2.真皮层制备：将获得的人成纤维细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养。用超纯水溶解猪胶原，取第5～10代的成纤维细胞，按照0.5×106/ml～3×106/ml的密度接种至已经溶解的胶原中，胶原浓度为0.4 g/ml；然后将此胶原和成纤维细胞的混合物倒于细胞培养皿中，待胶原凝固后，加入含10%胎牛血清的DMEM，置于5%CO2、37℃条件下培养，每隔48 h更换1次培养基，以接种成纤维细胞作为皮肤模型培养的第0天，记为D0。

3.表皮层制备：将从皮肤组织提取的人角质形成细胞使用KSFM培养基培养。接种成纤维细胞后皮肤模型培养的第3天（D3），将准备好的第3～7代角质形成细胞按照0.1×105～1.5×105个/cm2接种于真皮层表面，按文献［2］配制培养基，于5%CO2、37℃培养，每隔48 h换液1次，持续培养2周，培养结束后将皮肤模型放到OCT试剂中-20℃冻存，制备常规冷冻切片，或浸泡到4%甲醛中固定24 h，然后进行常规石蜡切片的脱水和包埋。

三、皮肤模型形态学观察

将石蜡切片脱蜡复水后，通过HE染色对培养得到的三维皮肤模型的组织结构进行观察，并与正常人皮肤组织进行对比；通过Masson染色进一步观察D17、D18、D19、D20、D24和D31时三维皮肤模型的表皮层变化。通过HE或Masson染色观察到该模型真皮中有活的成纤维细胞，表皮层分化良好，各层结构清晰且具有角质层，即可视为得到双层皮肤模型。

四、皮肤模型超微结构的电镜观察

将皮肤模型切成1～2 mm宽的细长条，戊二醛和锇酸双固定，常规制作透射电镜样本，然后对皮肤模型真皮层、基底膜、表皮层中的超微结构进行观察并拍照记录。

五、皮肤模型中各层标记物的检测

1.免疫荧光染色检测TG、K10、COLⅢ、COLⅣ、laminin 5和fibrillin表达：将冰冻切片放在冷甲醛中固定10 min，再放入PBS中清洗2次，各5 min，加入0.5%牛血清蛋白封闭1 h后，加入上述蛋白的一抗（TG抗体1∶1 000稀释，fibrillin抗体1∶50稀释，其余抗体均按1∶100稀释），过夜。次日，PBS清洗2次，各5 min，再加入二抗孵育1 h。PBS清洗，封片，在荧光显微镜下观察。

2.免疫组化染色检测皮肤模型中filaggrin、Ki67和COLⅠ表达：将5 μm石蜡切片浸入100℃柠檬酸钠缓冲液（0.01 mol/L，pH6.0）中30 min，冷却30 min至室温，加入上述蛋白的一抗（filaggrin、COLⅠ抗体1∶100稀释，Ki67抗体1∶50稀释），孵育1 h后按试剂盒说明书染色，苏木精核染5 min，光镜下观察。

结 果

一、皮肤模型的构建结果及形态学观察

按上述方法培养真皮3～4 d，培养表皮14 d，即共培养17 d（D17）时获得三维皮肤模型。该模型表皮具有较好的层状结构，包括基底层、棘层、颗粒层和角质层；真皮中具有充盈的胶原，且细胞均匀地分布于真皮层。三维皮肤模型表皮层及真皮层与正常人皮肤相近（图1）。D17、D18、D19、D20、D24和D31（继续培养14 d）时，三维皮肤模型表皮（不含角质层部分）不断变薄，表皮不断向上分化，角质层增加，仍具有稳定的结构，见图2。

图1 皮肤真表皮结构（HE×100）

二、三维皮肤模型的超微结构

透射电镜下，正在分化的三维皮肤模型的表皮层可观察到形态清晰的基底层、棘层、颗粒层和角质层；颗粒层含有透明角质颗粒，角质层含有脂质和角化桥粒（corneodesmosome）；细胞间有桥粒，且真表皮连接处具有完整的基底膜；真皮层可观察到成纤维细胞和胶原纤维，见图3。

三、皮肤模型中各层标记物的表达

在正常人皮肤和三维皮肤模型表皮中，TG、filaggrin、Ki67、K10均有明显表达（图4）；真表皮交界处COLⅣ及laminin5均正常表达（图5）；真皮层COLⅠ、COLⅢ、fibrillin均正常表达（图5）。

讨 论

图2 三维皮肤模型表皮层随培养时间的生长分化（Masson×250）

图3 三维皮肤模型表皮层、基底膜及真皮超微结构

图4 正常人皮肤与三维皮肤模型的表皮层免疫组化及免疫荧光染色（×250）

图5 正常人体皮肤与三维皮肤模型Ⅳ型胶原（COLⅣ）、层黏连蛋白5（laminin 5）、原纤维蛋白（fibrillin）、Ⅲ型胶原（COLⅢ）免疫荧光染色和Ⅰ型胶原（COLⅠ）免疫组化染色（×250）

皮肤模型已成为皮肤组织工程学发展的重要趋势。三维皮肤模型的发展影响了癌症生物学、药理学及基础细胞生物学的一系列研究领域［3-4］。这种模型也正在用于模拟疾病［5］，研究药物传播［6］以及人类器官发育机制［7］。目前重建人皮肤模型主要有表皮模型和全层皮肤模型，市面上用于销售的几种模型，已经有成熟的检测方法用以评估样品对皮肤的腐蚀性和刺激性［8-16］。随着新型生物相容性材料研发以及更复杂的细胞组分的掺入，皮肤模型的发展得到持续改进。本研究所构建的皮肤模型是以中国人皮肤来源的成纤维细胞、角质形成细胞为基础，该模型更符合东方人的皮肤结构特点，可用于筛选适合中国人皮肤的护肤品。

我们使用猪胶原与人成纤维细胞混合培养构建模拟皮肤的真皮层，再在其上层接种人皮肤角质形成细胞，通过真皮培养3～4 d，表皮培养14 d，成功构建三维皮肤模型。通过组化分析可以观察到表皮上具有较好的层状结构，包括细胞呈柱状排列的基底层，具有多层结构的棘层，向上逐步分化呈扁平状的颗粒层和无细胞核的角质层。真皮层上具有充盈的胶原，且成纤维细胞均匀分布于真皮层。而且角质层厚度随着接种角质形成细胞后时间增加而增加，继续培养14 d仍具有完整的表皮层结构。目前已有的一些皮肤模型，通常模型成熟后仅能维持3～7 d，且最后模型已无完整的表皮层结构，限制了使用模型进行检测的时间；而本研究用中国人皮肤重建的全层皮肤模型，在模型成熟收获后（即D17）仍能在体外维持完整结构长达14 d（即D31），并且表皮中仍具有6～7层含活细胞的角质层，大大增加了可供检测的时间，拓展了皮肤模型用于检测的范围和广度。

屏障功能是表皮的基本属性，受表皮脂质组成的影响［13-14，17］。电镜下可观察到，我们构建的三维皮肤模型表皮层具有多层结构，颗粒层中有透明角质颗粒，角质层中具有角化桥粒和脂质颗粒，它们均有助于屏障功能；角质形成细胞分化也通过分化标记物的表达模式得到验证；对不同分化阶段的标记物染色显示，该模型与人表皮分化过程相似；与表皮层细胞分化相关的TG正常表达，filaggrin可见于颗粒层细胞中，在基底层中可观察到与角质形成细胞分化相关的Ki67，早期分化相关的角蛋白K10在基底层以上表达。

电镜观察本研究构建的三维皮肤模型，有完整的基底膜。免疫荧光标记可以观察到基底膜相关蛋白COLⅣ和层黏连蛋白明显表达，说明该模型构建成功，具有完整的基底膜。同时，电镜观察到该三维皮肤模型真皮层具有胶原纤维和成纤维细胞。免疫荧光标记显示，真皮层中filaggrin、COLⅠ和COLⅢ胶原在三维皮肤模型中的表达类似于正常人皮肤。

总之，用中国人皮肤构建的三维皮肤模型与正常人皮肤具有较高的相似性，可以作为中国化妆品研究的有利工具，也可以用来开发体外替代物和毒理学测试研究，但和正常皮肤相比，本研究构建的3D皮肤模型没有黑素细胞、免疫细胞以及神经细胞，同时也缺乏毛囊、皮脂腺、汗腺等皮肤附属器。因此不能用于涉及以上细胞及附属器的生物学研究中。