复方公英散对大鼠宫腔粘连组织IL-8及TNF-a表达的影响

刘 敏，赵大鹏，吴兴国，王咏梅

（山东省泰安市中心医院，山东 泰安 271000）

宫腔粘连（intrauterine adhesions，IUA）亦称阿是曼综合征（Asherman syndrome），于1894年由Fritsch首次报道［1］，明确定义其为子宫内膜基底层损伤后修复障碍导致宫腔部分或全部粘连闭塞，常伴发月经异常、周期性腹痛、不孕及反复流产等临床表现［2］。目前，宫腔粘连的发病机制尚未明确，子宫内膜基底层的损伤被认为是导致宫腔粘连的关键因素［3］，炎症介导的子宫内膜的损伤也在宫腔粘连的发病机制中起着决定性的作用［4］。白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）与肿瘤坏死因子-a（tumor necrosis factor-a，TNF-a）是近年来研究较多的与炎症发病相关的因子。IL-8与TNF-a两者特异性结合，在炎症细胞的黏附、渗出、侵袭、增殖等过程中发挥重要的生物学作用。有研究发现，宫腔粘连患者纤维化内膜及病灶周围组织中，均有IL-8和TNF-a的表达，且纤维化内膜组织中的表达明显高于正常内膜组织，说明IL-8、TNF-a在子宫内膜纤维化的发生、发展过程中起一定作用［5］。

本课题通过RT-PCR的检测方法测定IL-8及TNF-a在大鼠宫腔粘连组织中的表达，探讨IL-8及TNF-a在大鼠子宫纤维化内膜中的表达及观察复方公英散对其表达的影响，为阐明宫腔粘连的发病机制及复方公英散的推广使用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物健康成熟未曾交配过的雌性SD大鼠45只，体质量250～280g，购自山东大学附属齐鲁医院实验动物中心（动物使用许可证SCXK鲁2017-0001）。自然光照，常规饲养。

实验药物复方公英散来源于泰安市中心医院妇科临床经验方。由蒲公英30g，赤芍20g，丹皮20g，薏苡仁30g，三七粉6g，白芷10g，红藤20g，桂枝15g，连翘15g，甘草10g组成，经提取精制而成。

1.2 方法

动物模型：采用非动情期刮宫法建立大鼠宫腔粘连模型［6］，建模在无菌操作下进行。消毒备皮区皮肤，腹腔注射水合氯酵麻醉，取下腹正中纵切口，寻找双侧子宫。取一侧子宫，于子宫分叉右上方行切口，尽量避开血管，刮勺搔刮右宫腔，当搔刮子宫四壁感觉粗糙时，停止刮宫。

分组给药：SD雌性大鼠30只，按照上述造模方法制作大鼠宫腔粘连动物模型。造模7天后随机分为模型组和复方公英散组各15只，每只动物每天灌胃1次，每组均连续给药28天。具体分组和给药剂量如下：①空白组用生理盐水；②模型组用生理盐水；③复方公英散组用复方公英散0.4g/mL。以上各组均按每天每100g体质量1mL计算给药。

标本获取：各组大鼠于末次给药24h内行大鼠脱臼猝死开腹，取各组正常子宫内膜和纤维化内膜组织，放入液氮并转入-80℃冰箱。

1.3 RT-PCR

采用RT-PCR法检测各组内膜组织中IL-8及TNF-a mRNA的表达（逆转录试剂盒和RNA 提取试剂购自山东腾云生物科技有限公司）。引物设计：IL-8上游引物5'-CATGGATCTGTCGTAGGGCT-3'，下游引物5'-CTGACCAACAGACCAGGGTT-3'；TNF-α上游引物5'-ATGGTCACCCTCAGATCAGC-3'，下游引物5'-TTGACCGCTGAA GAG ACCCT-3'；GAPDH上游引物5' -ATGTTTGTGATG GGCGTG AACC-3'，下游引物5'-CCCAGCATCGAAGGTAGAGGA-3'。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；IL-8 55℃退火30s；TNF-α58℃退火30s；72℃延伸30s，共35个循环；72℃最后延伸7min。

2 结 果

模型组大鼠纤维化内膜组织与空白组正常子宫内膜组织中IL-8 mRNA的表达比较差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组及正常子宫内膜组织均有表达TNF-a mRNA，分别为3.004±0.264、0.360±0.421，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。给药28天后，治疗组内膜组织IL-8 mRNA表达下降，与模型组及空白组比较，差异均有统计学意义；治疗组TNF-mRNA的表达下降，与模型组及空白组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 模型组及空白组中IL-8mRNA、TNF--a mRNA表达比较 （±s）

表1 模型组及空白组中IL-8mRNA、TNF--a mRNA表达比较 （±s）

组别 例 mRNA IL-8 TNF-a模型组 10 2.861±0.427 3.004±0.264空白组 10 0.216±0.043 0.360±0.421治疗组 10 0.646±0.264 0.587±0.476

3 讨 论

宫腔粘连是由于宫腔操作术中冲任胞宫，胞脉受金属器械所伤，离经瘀血形成。患者湿热内袭，蕴于下焦，若术后起居失宜、摄生不慎，外邪袭内，入于胞中，与瘀搏结，以致闭经；或术前即有生殖系统感染，术后发作，此时湿热淚结滞于胞络之间，便形成纤维粘连。湿、热、瘀血是宫腔粘连的主要病理基础，可类比于现代医学之“炎症反应”与“纤维化病变”：炎症反应属于早期发病阶段，此时由于湿与热困阻于胞络，粘连较少或尚未形成，但局部炎性缺氧缺血状态己经形成，为粘连的形成创造了环境基础。到炎性反应末期，湿热与瘀血搏结，瘢痕化形成，发生内膜纤维化改变，腔镜下观察粘连带呈机化，白色索状粘连。

现代医学研究认为，白细胞介素多在炎症反应中作用广泛，也可调节免疫机能。IL-8属于C-X-C亚家族，其来源于如中性粒细胞、血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞等等，是一种庭化性细胞因子，可激化活嗜中性粒细胞，具有调节免疫和炎症反应的作用［7］。肿瘤坏死因子－a（TNF-a）可产生炎症介质，参与炎症反应，调节免疫机能，是一种促炎因子［8］。TNF-a在创伤修复过程中会促发成纤维细胞增生，促进伤口愈合。子宫内膜受到损伤后的愈合过程与伤口愈合类似。因此推测IL-8、TNF-a与宫腔粘连具有相关性。

复方公英散是赵锡民教授根据宫腔粘连“湿热淚结”的病机，遵循辨证与辨病相结合的原则，谨守病机特点，兼容自己多年之潜心研究而成。该方采用颗粒剂型，药物组成包括蒲公英、赤芍、丹皮等，具有活血化瘀、清热渗湿之功效。临床研究表明，复方公英散可抑制子宫内膜纤维化病灶的生长，减少闭经等症状，且在宫腔镜治疗宫腔粘连术后有抑制其复发作用。基于以上，本研究观察大鼠子宫内膜组织中IL-8、TNF-a表达，发现大鼠纤维化内膜组织的表达高于正常子宫内膜组织。而且复方公英散可影响宫腔粘连组织IL-8、TNF-a的表达，说明复方公英散对大鼠子宫内膜纤维化的治疗作用可能与抑制IL-8、TNF-a的表达有一定关系。通过本研究为进一步探讨宫腔粘连的发病机制及复方公英散的治疗作用和推广使用提供了理论依据。