酵母菌发酵降低L-苏氨酸母液糖含量的工艺研究

◎ 郑立国，邹应立，于艳萍

（1.吉林大学动物科学学院，吉林 长春 130000；2.长春大成实业集团有限公司，吉林 长春 130000）

苏氨酸是人体必需氨基酸之一，有缓解人体疲劳、促进生长发育的效果[1]。随着养殖业的发展和工艺水平的提高，以淀粉等糖质为主要原料，经微生物深层发酵、提取、精制而成L-苏氨酸的发酵技术得到广泛应用[2]。该技术具有投资少、见效快，经济与社会效益显著等诸多优点[3]，然而生产过程中剩余的母液有化学含氧量高等特点，不可直接排放[4]，严重困扰着发酵行业[5]。国外采取膜分离技术分离营养物质、无机盐等方法处理母液，具有工艺复杂、设备及工艺要求较高、成本高的特点；国内一般采用二次提取，母液污水处理后直排的方法[6]，但存在高浓度有机废水的处理费用高、周期长、对环境影响较大等问题[7]。一部分企业采用母液制造化肥或再提取工艺处理母液[8]，存在环境污染严重、成本高、质量不稳定等问题。

本试验将苏氨酸母液糖化后，用酵母菌发酵将还原性糖转化为酒精、二氧化碳和水，这样有利于降低母液黏度，方便对苏氨酸母液中残留的苏氨酸二次提取和废液处理[9]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

啤酒酵母菌，购自青岛慧瑞生物科技有限公司；糖化后的苏氨酸母液，由大成生化科技松原有限公司提供。

1.2 仪器设备

生化培养箱（上海科晓科学仪器有限公司）、TDL-80-2B型离心机(上海安亭科学仪器厂)、超净工作台单人双面（山东博科生物产业有限公司）、722分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）、分析天平(上海奕宇有限公司)、摇瓶机（金坛市良友仪器有限公司）。

1.3 发酵条件的确立

1.3.1 接种量对糖化后苏氨酸母液发酵的影响

分别量取300 mL糖化后的苏氨酸母液于5个三角烧瓶中，调pH值在4.0～4.5，分别加入0.5%、0.75%、1%、1.5%和2%的啤酒酵母干粉。先好氧培养，6 h之后再盖上瓶盖厌氧培养。

1.3.2 发酵温度对糖化后苏氨酸母液发酵的影响

分别量取300 mL，调pH值在4.0～4.5，加入1.3.1确定的啤酒酵母干粉量。先好氧培养，6 h之后再盖上瓶盖厌氧培养，分别为在30、31、32、33 ℃和34 ℃的恒温培养箱中培养。

1.3.3 发酵时间对糖化后苏氨酸母液发酵的影响

分别量取300 mL，调pH值在4.0～4.5，加入1.3.1确定的啤酒酵母干粉量。先好氧培养，6 h之后再盖上瓶盖厌氧培养，在1.3.2确定的培养温度下分别培养6、12、18、24 h 和 30 h。

1.4 检测方法

1.4.1 还原糖测定方法

（1）化学反应：

CuSO4+KI=I2+CuI+2K2SO4

I2+2Na2S2O3=2NaI+Na2S4O6

（2）试剂。A液：硫酸铜；B液：酒石酸钾钠、氢氧化钠；C液：碘化钾；D液：硫酸；E液：硫代硫酸钠、无水碳酸钠；2%淀粉指示剂；浓盐酸；0.2%甲基红指示液；40%NaOH；0.1N K2Cr2O7标液的配制：准确称取4.903 g经140～150 ℃烘干至恒重的K2Cr2O7溶于200 mL水中，完全溶解后，移至1 L容量瓶中，以蒸馏水稀释至刻度。

（3）葡萄糖的测定（RS值）。向已加入30 mL蒸馏水的250 mL锥形瓶中加入1.00 mL样品，摇匀，准确加入10 mL A液、10 mL B液后置于电炉上加热至沸腾后计时2 min，取下锥形瓶冷却至室温，向其中加入10 mL C液与10 mL D液，立即用E液滴定，近终点时，加入一管淀粉指示剂，继续滴定至淡粉色即为滴定终点。同时做空白（空白时终点为淡紫色）。

计算公式。

D=F×(VA-VB)；F=VK÷VE；C=G÷10×0.95

式中，D为消耗标液的系数；VA为A液体积（空白滴定量），单位mL；VB为B液体积（样品滴定量），单位mL；F为E液因数；VK为K2Cr2O7标液体积，单位mL；VE为消耗E液体积，单位mL；C为苏氨酸母液中葡萄糖浓度，单位g/dl；G为由得出的D值对应糖表的葡萄糖浓度，单位g/dl。

1.4.2 总糖的测定方法

用移液管准确移取5.00 mL样品，加入90～100 mL蒸馏水、5 mL浓盐酸，置于500 mL锥形瓶中（移液管需用少量蒸馏水冲洗二次），加塞，塞上插有一玻璃弯管，用纱布包好，置于100 ℃的水浴锅内水解2 h后取出，冷却后清洗瓶塞、锥形瓶，加入2 d甲基红指示液，用氢氧化钠调成黄色，定容至500 mL。

从中取出5.00 mL，测定方法同葡萄糖。

计算公式。

D=5×(VA-VB)×F；F=VK÷VE；C=G÷10×0.95

式中，D为消耗标液的系数；VA为A液体积（空白滴定量），单位mL；VB为B液体积（样品滴定量），单位mL；F为E液因数；VK为K2Cr2O7标液体积，单位mL；VE为消耗E液体积，单位mL；C为苏氨酸母液中葡萄糖浓度，单位g/dl；G为由得出的D值对应糖表的葡萄糖浓度，单位g/dl。

2 结果与讨论

2.1 接种量对糖化后苏氨酸母液发酵的影响

采用对比方法，设置相同培养条件，5个培养瓶中分别添加0.5%、0.75%、1%、1.5%和2%的酵母菌粉。温度为32 ℃的培养条件下培养24 h检测，记录实验数据。如图1所示，随着接种量的提高，还原糖、总糖含量会逐渐降低。然而当达到1.5%及2%时，降低虽然比1%添加量大，却无明显差异。根据成本控制原理，确定1%为最佳添加量。

图1 接种量对苏氨酸母液糖浓度的影响图

2.2 发酵温度对糖化后苏氨酸母液发酵的影响

啤酒酵母在适度温度情况下，作用效果较好。温度对酵母菌的影响直接决定了效果。在确定了最佳接菌量后，根据酵母菌培养特性，适度调整接菌温度，分别在30、31、32、33 ℃和34 ℃温度条件下进行培养。试验中经过24 h培养后，对比5种温度培养条件下还原糖、总糖变化情况。记录实验数据。如图2所示，几种培养条件下，还原糖明显降低。在32 ℃培养条件下还原糖、总糖降低幅度最大，因此确定32 ℃为最佳培养温度。

图2 发酵温度对苏氨酸母液糖浓度的影响图

2.3 发酵时间对糖化后苏氨酸母液发酵的影响

在发酵过程中，发酵时间是根据菌种作用效果及产量与能耗对比值确定的。在菌种作用接近最佳效果时，应立即结束培养，否则产量与能耗不成正比，而造成成本降低。

在确定最佳接菌量、最佳培养温度后，实验确定培养时间对还原糖、总糖的作用效果。分别在12、15、18、21 h和24 h进行取样检测，并记录检测结果。如图3所示，培养随时间增长而逐渐效果明显，在18 h后，作用效果便缓慢，确定18 h后继续培养成本价值低，因此确定最佳培养时间为18 h。

图3 发酵时间对苏氨酸母液糖浓度的影响

3 结论

经过酵母菌处理后的糖化母液还原糖、与总糖明显降低，更利于再浓缩提取。总收率比未处理的母液收率高，同样在膜过滤处理过程中收率提高约1.3%，此实验方法具有一定可行性。在大生产中具有相当优势，有一定利润空间。

对啤酒酵母菌作用糖化母液的培养条件中的接菌量、发酵温度、发酵时间进行了确定。在母液处理与综合利用和检测方面论述了应用的可行性。酵母菌菌种在适当条件下对还原糖进行利用，转化为酵母菌体蛋白。证明酵母菌对残糖的利用价值。为发酵行业母液处理提供了全新的思路。