回阳生肌膏联合重组人表皮生长因子治疗激素与免疫抑制剂致大鼠皮肤溃疡的效果及机制

孙 超 邹 婕

(武汉市皮肤病防治院，湖北 武汉 430000)

糖尿病(DM)诱发的皮肤溃疡是临床一大疑难症，症状顽固，迁延不愈，反复发作。DM诱发的皮肤溃疡病机与患者激素水平及免疫系统异常有关〔1〕。中医将这类由DM诱发的皮肤溃疡归属为“疮疡”，《灵枢·痈疽》中提到：寒邪客于经络之中则血泣，血泣则不通，不通则卫气归之，不得复反，故痈肿。寒气化为热，热胜则腐肉，肉腐则为脓。即本病难愈与“腐”有关，因而治疗需要以去“腐”生肌为主〔2〕。回阳生肌膏是中医常用的慢性皮肤溃疡治疗药方之一，药方由肉桂、炮姜、黄芪、人参等多味温阳益气，活血生肌药物组成，具有较高临床效果。本研究旨在探究回阳生肌膏联合重组人表皮生长因子治疗激素与免疫抑制剂致大鼠皮肤溃疡的实验效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取SPF级成年雄性SD大鼠72只，平均体重(200±20)g，均购自重庆腾鑫生物技术有限公司，均自由进食进水，喂养于22～25℃，光照12 h，相对湿度45%～60%的环境中。

1.2实验仪器与药品 回阳生肌膏由广州医科大学附属中医院制剂中心提供；ATCC25923金黄色葡萄球菌由广州医科大学附属中医院免疫研究生提供；氢化可的松、水合氯醛、柠檬酸、链脲佐菌素(STZ)由天津金耀氛基酸有限公司提供。罗氏卓越纤巧型血糖仪及配套试纸购自罗氏诊断产品有限公司；DH4000AB型电热恒温培养箱由天津市泰斯特仪器有限公司生产；光学显微镜由日本OLYMPUS公司生产。

1.3造模方法 采用随机数字表法分为正常组、模型组、实验组A和实验组B各18只。模型组、实验组A和实验组B进行造模，操作如下：将50 mg/kg STZ注入0.1 mol/L柠檬酸，制成STZ溶液，造模大鼠每只注入10 ml STZ溶液，随后每天注射10 ml STZ，常规喂养，3 d后视为大鼠DM造模成功。给予大鼠水合氯醛麻醉，剃除背部毛发，剪皮至筋膜，将20 mm直径消毒塑胶环埋入切口边缘，缝合，包扎。

1.4实验方法 在造模成功后，实验组A给予回阳生肌膏纱条覆盖创面，实验组B采用含有回阳生肌膏和重组人表皮生长因子凝胶的纱条覆盖创面，正常组和模型组均只给予含有凡士林的纱条覆盖创面，每天换药1次，给药15 d。

1.5观察指标及检测方法 观察各组大鼠用药前、用药第4、7、14天的溃疡面面积及第14天时创面愈合率=(给药前创面面积-未愈合创面面积)/给药前创面面积×100%，对比治疗第3、10天血清转化生长因子(TGF)-β、白细胞介素(IL)-6；肉芽组织中血管内皮生长因子(VEGF)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、IL-6水平。血清TGF-β、IL-6采用放射免疫法检测，试剂选用北京福瑞生物工程公司提供的相关试剂盒，操作严格按照相关说明书进行。肉芽组织VEGF、eNOS、IL-6检测选用免疫组织化学方法：常规包埋、切片、脱蜡，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，选用3%H2O2溶液温室孵化15 min，洗涤，将切片送入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中修复10 min，滴入VEGF、TGF、eNOS、IL-6一抗，冷藏，二抗，显色，复染，封片，检测。

1.6统计学方法 采用SAS10.0统计软件进行单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组创面愈合比较 用药前，各组溃疡创面面积差异无统计学意义(P>0.05)；用药第3、7、14天，实验组A、B溃疡创面面积均显著小于模型组(P<0.05)，实验组B溃疡创面面积均显著小于实验组A(P<0.05)；用药第14天溃疡愈合率比较，实验组B>实验组A>模型组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见图1，表1。

用药14 d图1 各组用药3、7、14 d创面愈合情况

组别溃疡面积(cm2)用药前用药3 d用药7 d用药14 d第14天溃疡愈合率(%)正常组-----模型组4.70±0.693.66±0.572.50±0.361.19±0.4474.68±3.57实验组A4.62±0.803.12±0.431)1.51±0.321)0.58±0.301)87.45±3.291)实验组B4.68±0.792.69±0.471)2)1.03±0.291)2)0.16±0.091)2)96.58±2.041)2)

与模型组比较：1)P<0.05；与实验组A比较：2)P<0.05

2.2各组血清TGF-β、IL-6比较 用药第3、10天，模型组血清TGF-β与正常组差异无统计学意义(P>0.05)，模型组血清IL-6显著高于正常组(P<0.05)；用药第3、10天，实验组A、B血清TGF-β显著高于模型组(P<0.05)，血清IL-6显著低于模型组(P<0.05)；用药第3、10天，实验组B血清TGF-β显著高于实验组A(P<0.05)，血清IL-6显著低于实验组A(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清TGF-β、IL-6比较

与模型组比较：1)P<0.05；与实验组A比较：2)P<0.05；与正常组比较：3)P<0.05；表3同

2.3各组肉芽组织中VEGF、eNOS、IL-6表达水平比较 用药第3、10天，模型组肉芽组织中eNOS表达水平显著低于正常组(P<0.05)，VEGF、IL-6表达水平显著高于正常组(P<0.05)；用药第3、10天，实验组A、B肉芽组织中eNOS、VEGF表达水平显著高于模型组(P<0.05)，IL-6显著低于模型组(P<0.05)；用药第3、10天，实验组B肉芽组织eNOS、VEGF表达水平显著高于实验组A(P<0.05)，IL-6显著低于实验组A(P<0.05)。见表3。

表3 各组肉芽组织中VEGF、eNOS、IL-6表达水平比较

3 讨 论

DM诱发的皮肤溃疡其病变区域皮肤组织在完整性和连续性损伤之前，就出现组织学及细胞生物学病变，故临床认为本类皮肤溃疡属于内源性〔3〕。这种内源性病因导致的皮肤溃疡又因为创伤处相关生长因子异常表达而出现延迟愈合，反复发作等情况〔4〕。因而，治疗本类皮肤溃疡的关键在于恢复创伤处的相关细胞生长因子表达，维护病变区域组织生长、恢复相关调控机制的平衡。

中医学者认为DM内源性皮肤溃疡属于阴证疮疡，其病机为阳衰阴亏，治疗需以温阳益气、活血生机为主〔5〕。《素问·阴阳应象大论》中提到：“阴阳者，万物之能使也”，“阳化气，阴成形”，认为阳气是血肉肌肤生成的关键〔6〕。TGF-β的主要功能表现为促纤维细胞增殖，促趋化炎症细胞聚集，调节细胞外基质合成，促肉芽组织生长及表皮生成〔7〕。已有研究显示，外源性TGF-β在诱导上皮细胞增殖，加速角化运动，增强角蛋白表达上具有显著效果〔8〕。IL-6则是前炎性介质的一种，是机体抗菌炎症反应的重要参与因子，对内皮细胞、成纤维细胞增殖具有重要作用。IL-6还可调节免疫应激反应进而促进相关细胞分化、增殖，最终参与创面修复。本研究提示回阳生肌膏联合重组人表皮生长因子治疗内源性大鼠皮肤溃疡疗效最佳，大鼠创伤区域相关生长、修复因子明显高表达。VEGF是血管内皮细胞特异有丝分裂原，是目前公认的最强促血管生成因子。VEGF可通过自分泌和旁分泌方式促进血管内皮细胞分化、趋化〔9〕。eNOS是存在于内皮细胞、巨噬细胞等细胞中的一种同工酶，具有调节血管功能的效果。回阳生肌膏由肉桂、炮姜、黄芪、人参、当归等药组成〔10〕。现代医学研究发现，当归等活血药物在促VEGF表达，加速内皮细胞增殖、分裂、迁移上具有极高疗效，可以有效促进人体血运，防止血管缺血坏死，并且还可以促进新生血管生成〔11〕。重组人表皮生长因子对机体多种组织细胞具有极强的促分裂作用。创面修复主要通过肉芽填充完成，而肉芽组织则主要由纤维细胞、新生血管构成。因此，加强创面纤维细胞增殖及新生血管生成是创面治疗的根本〔12〕。