Micro-CT和骨力学测试观察刺老苞根皮对骨折大鼠的作用

依香叫 燕梦云 王松月 李金诚 裴凌鹏

中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081

骨折是一种常见型临床多发病。据文献报道[1]，随着人口老龄化，预计到2020年，我国由骨质疏松症导致髋部骨折人数将近163.82万；到2050年，全球一半以上由骨质疏松症导致的骨折病症将发生在亚洲。因此，骨质疏松的防治及骨折的治疗是国内外学者的研究热点。本课题组所研究的刺老苞根皮是我国少数民族土家族习用草药之一，为五加科楤木属植物楤木(Aralia echinocaulis Hand. Mazz)及其变种白背叶楤木(Aralia chinensis L. var. nuda Nakai)的根皮或茎皮。具有滋阴补肾，祛风湿，壮筋骨，散淤血，消肿毒的功效。主要用于风湿痹痛、跌打损伤、骨折等治疗。在治疗骨相关疾病上，有着简、便、廉、验的特点。以往研究[2,3]已通过临床试验证明刺老苞胶囊对膝关节骨性关节炎有一定的疗效，并且刺老苞根皮提取物能够通过骨代谢、脂代谢及激素代谢促进由糖皮质激素诱发的骨质疏松大鼠骨组织的骨量、骨质和骨碱性磷酸酶活性[4,5]，并且可改善胫骨骨折模型大鼠的骨质代谢[6]。为了深入阐述刺老苞根皮对骨修复的作用，本次试验以3月龄SD胫骨骨折模型大鼠为研究对象，应用骨力学检测和Micro-CT检测观察不同浓度刺老苞根皮水提物对不同时间胫骨骨折模型大鼠的修复作用，进一步为临床治疗和应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雌性SD大鼠60只，3月龄，体重(270±20) g，由中国人民解放军军事医学科学院实验室动物中心提供，许可证编号：SCXK-(军)2012-0004。标准动物房饲养，自由活动及饲料(普通Ⅱ号料)正常进食。

1.2 药品与仪器

刺老苞根皮，采于湖北恩施地区(经北京中医药大学生药系杨瑶珺教授鉴定)，批号：OP1101，湖北恩施中药材有限公司。

自动旋转蒸发仪(上海亚荣生化器)，Skyscan 1174 X-Ray Microtomograph(比利时Bruker公司)，Qwin Pro V3.5.0图像分析系统(德国Leica公司)，临床生物力学三点弯应变检测仪(上海医学仪器设备总公司)。

1.3 实验动物模型建立

SPF级健康雌性SD大鼠60 只，通过在胫骨上打孔模拟骨折二期愈合的理想力学环境。模型建立具体方法：60只SD雌性大鼠适应性喂养一周后，用浓度为3 %戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉。将动物固定后，左下肢脱毛，皮肤消毒。无菌条件下，自胫骨结节下端起，沿胫骨走行，做纵行切口，长1 cm。切开皮肤、皮下筋膜，剥开胫前肌，显露胫骨。在胫骨结节下端2 mm处，用镶嵌1 mm克氏针的打孔器自胫骨外侧向胫骨内侧打孔，直径为1 mm，钻透皮质深达髓腔，但不触及对侧皮质。在该孔下沿胫骨纵轴方向依次再打2个孔，每两个孔的间距为5 mm。用生理盐水彻底冲洗，滴1～2滴青霉素(80万U/mL)逐层缝合切口。术后3 d连续肌注青霉素8万U/只，预防感染。动物分笼饲养，术后第二天按实验分组设计进行处理。

1.4 实验分组设计及给药

术后第二天用SPSS软件随机数字的方法分成4组，分别为模型组(MODEL)、刺老苞根皮低剂量组(CLB-L)、刺老苞根皮中剂量组(CLB-M)、刺老苞根皮高剂量组(CLB-H)，每组15只，参考骨折愈合药物治疗周期，每组设定3个观测时间点，即14、21、28 d，每时间点5只。

取一定量干燥刺老苞根皮生药置于圆底烧瓶中，加入10倍的蒸馏水，待沸腾后，120 ℃加热，60 min后停止加热，待冷却后倒出煎液，再加入6倍蒸馏水，待沸腾后，120 ℃加热，30 min后，冷却倒出煎液，合并两次水煎液。将混匀的水煎液置于自动旋转蒸发仪中，浓缩至每100 mL含生药36 g的水煎剂。用药剂量根据人体习用安全剂量(20 g生药/70 kg体重)，按人/鼠表面积比率换算等效计量法计算。刺老苞根皮灌胃剂量为1.8 g/(kg·d)，以临床剂量为中剂量，1/2、2倍剂量为低、高剂量, 即分别为0.9 g/(kg·d)、1.8 g/(kg·d)。模型组给予等剂量等频率蒸馏水，每天一次。

1.5 取材

分别于相应时间点取材(取材前禁食12 h)，末次给药后1 h，称重，3%戊巴比妥钠(3 mg/kg)腹腔注射麻醉，在无菌操作下腹主动脉采血，取双侧胫骨，剥离肌肉及筋膜。经生理盐水冲洗后，用湿润生理盐水纱布包好，保证骨组织内水分不丢失，置于-20 ℃冰箱保存，用于骨力学检测包括骨的结构力学参数(弹性挠度、弹性载荷、最大挠度、最大载荷)和生物力学参数(最大应力、最大应变、弹性应力、弹性应变)，Micro-CT检测胫骨骨折部位骨组织形态参数(BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和SMI)检测。

1.6 骨力学检测

检测时，取出-20 ℃保存的标本，用临床生物力学三点弯应变检测仪分析大鼠右侧胫骨的骨力学性能。大鼠生物力学实验时参数设置如下：最大载荷20 kg，压头对准断端，跨度为18～22 mm，加载速度5～l0 mm/min，记录纸速度500 mm/min，室温控制在20 ℃。计算并绘制载荷-位移关系曲线、应力-应变关系曲线，从曲线上读取及计算弹性挠度、弹性载荷、最大挠度、最大载荷、最大应力、最大应变、弹性应力、弹性应变等骨力学参数。

1.7 Micro-CT测量

检测前，将左侧胫骨浸泡于生理盐水，待24 h后采用 Micro-CT 对其进行组织形态指标检测：将胫骨放置于Micro-CT的标本管内，并用湿纸巾缠绕固定，防止扫描过程标本的脱水及移位。采用Skyscan1174型Micro-CT的Scaner软件进行扫描，参数设定为：电压50kV，电流800 μA，扫描空间分辨率12 μm，断层图像分辨率1304×1024 pixel，旋转角度0.8 度，曝光时间5 300 ms，扫描完成后，用Data viewer软件校值，再用 CT-AN 软件选择感兴趣区域(ROI)，最后用CT vox软件进行三维重构和分析。ROI选择在距长板 1 mm 以下，厚度为 1.5 mm 的骨髓腔区域。分析得到以下参数：骨体积(bone volume，BV)、骨痂体积(total volume，TV)、骨体积分数(bone volume/total volume，BV/ TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁结构模型(structure model index，SMI)。

1.8 数据处理

2 结果

2.1 各组大鼠胫骨力学参数的变化

与MODEL组相比，不同时间点，各剂量组的骨结构力学参数有所提高。其中CLB-M组在14 d时最大挠度、最大载荷高于MODEL组(P<0.05)；21 d时弹性挠度、最大挠度、最大载荷明显升高，与MODEL组相比差异有统计学意义(P<0.05)。28 d时弹性挠度、弹性载荷、最大挠度、最大载荷皆高于MODEL组(P<0.05)。CLB-H组在14、21、28 d时，弹性挠度、弹性载荷、最大挠度、最大载荷明显高于MODEL组，差异有统计学意义(P<0.05)。

与MODEL组相比，最大应力在14 d时，CLB-H组上升，21 d时CLB-M组、CLB-H组上升，28 d时各剂量组上升，差异有统计学意义(P<0.05)；各剂量组最大应变高于MODEL组，但差异无统计学意义(P>0.05)；弹性应力在14 d时各剂量组升高(P<0.05)，21、28 d时，CLB-M组、CLB-H组升高(P<0.05)，弹性应变则在14、28 d时，CLB-H明显高于MODEL组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组大鼠胫骨Micro-CT定量参数的变化

经Micro-CT检测显示：BV/TV在14 d时，CLB-H组高于MODEL组(P<0.05)；21 d时CLB-M、CLB-H组高于MODEL组(P<0.05)；28 d时，CLB-M组高于MODEL组(P<0.05)，CLB-H组明显高于MODEL组(P<0.01)。Tb.Th、Tb.N在21、28 d时CLB-M组、CLB-H组明显高于MODEL组(P<0.05或P<0.01)。Tb.Sp在21 d时CLB-M组、CLB-H组与MODEL组相比有所降低(P<0.05或P<0.01)；28 d时各剂量组与MODEL组相比皆有所降低。(P<0.05或P<0.01)。SMI在21、28 d时CLB-M组低于MODEL组(P<0.05)，21、28 d时CLB-H组明显低于MODEL组，且差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 各组大鼠胫骨Micro-CT的三维图

第28天各组大鼠胫骨骨折部位ROI区重构图像(见图1)发现骨折处MODEL组骨髓腔接近封闭，其余各剂量组完全封闭，说明机体处于骨痂改建期，并且骨损伤处接近正常状态。由图2可知，7 d时骨髓区大片无骨小梁。14 d时骨内微结构开始形成，骨小梁稀疏、细小、排列不均。21 d时皮质骨逐渐与骨痂相连，小梁骨逐渐增粗。28 d时骨髓腔逐渐封闭，骨小梁结构紧密，粗细均匀，连续性良好，网状结构趋于正常的骨组织。综合上述结果表明各剂量组对骨的修复作用优于模型组。

表1 刺老苞根皮提取物对大鼠骨力学参数的影响Table 1 Effect of aralia echinocaulis extract on rat bone mechanical

注：与模型组比较：*P<0.05。14 d-MODEL为第14天模型组，14 d-CLB-L为第14天刺老苞根皮低剂量组，14 d-CLB-M为第14天刺老苞根皮中剂量组，14 d-CLB-H为第14天刺老苞根皮高剂量组，21 d-MODEL为第21天模型组，21 d-CLB-L为第21天刺老苞根皮低剂量组，21 d-CLB-M为第21天刺老苞根皮中剂量组，21 d-CLB-H为第21天刺老苞根皮高剂量组，28 d-MODEL为第28天模型组，28 d-CLB-L为第28天刺老苞根皮低剂量组，28 d-CLB-M为第28天刺老苞根皮中剂量组，28 d-CLB-H为第28天刺老苞根皮高剂量组。

表2 Micro-CT测定各组大鼠胫骨相关参数的改变Table 2 Changes of tibia microstructural parameters of rats in different

注：与模型组相比较：*P<0.05，**P<0.01

图1 第28 d各组大鼠胫骨Micro-CT的三维图Fig.1 Micro-CT images of different groups at 28 days after the operation

图2 不同时间点刺老苞根皮高剂量组大鼠胫骨Micro-CT的三维图Fig.2 Micro-CT images of the high dose group at different time points

3 讨论

本实验利用三点弯曲实验检测骨折愈合的机械性能，通过外界作用下使骨组织受力，并检测其力学性能和产生的生物学效应。可应用于评价药物对骨相关疾病治疗的指标[7,8]。在测试结束后，可以对胫骨的强度、刚度、硬度、韧性和弹性等骨结构力学参数和骨生物力学参数做出评估。通过此实验结果显示，从14 d到28 d与模型组相比，中、高剂量组的骨结构力学参数有所提高，并且从14 d到28 d时中、高剂量组的骨生物力学参数也高于模型组。提示内服刺老苞根皮可通过改善骨折部位骨微小结构，提高骨密度，促进骨组织结构完整性，从而提升骨的抗冲击和变形能力，使其韧性和可塑性增强，骨组织强度增加，使胫骨的结构力学和生物力学性能得以提高。

目前，评价骨折愈合的组织形态学方法很多，骨整合和骨结构则是由组织学和免疫组织化学以二维方式进行，骨量化、结构及矿化则是由Micro-CT断层扫描以三维方式进行[9-12]。与二维组织学和免疫组织化学技术相比，Micro-CT是无破坏性的技术，并能在体外提供骨骼三维图像[13]。因此Micro-CT扫描测量分析技术已被广泛应用于评估生物材料和组织中[14]，通常被作为从宏观和微观角度评价骨质量的辅助技术。现已在大量开放性骨折和闭合性骨折实验中证明Micro-CT扫描技术在分析和评价骨折愈合上具有可靠性。本实验选择Micro-CT三维形态参数中BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、SMI作为评价骨折愈合参数。BV/TV是相对骨体积分数；Tb.Th是骨小梁的平均厚度；Tb.N是指给定长度内骨组织与非骨组织的交点数即骨小梁数量；Tb.Sp是指骨小梁之间的髓腔平均宽度，Tb.Sp值的减少提示骨形成的增加；SMI是结构模型指数，用于定义骨小梁板状和杆状的程度，板状骨小梁和杆状骨小梁的SMI数值分别是0和3。骨组织受损后，骨小梁从板状向杆状转变，SMI数值增加。通过Micro-CT实验结果提示，与MODEL组相比， BV/TV、Tb.Th、Tb.V在21、28 d时CLB-M组、CLB-H组明显升高(P<0.05或P<0.01)；Tb.Sp、SMI在21、28 d时，CLB-M组、CLB-H组明显低于MODEL组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。提示刺老苞根皮能够使骨体积、骨结构和链接密度明显提高，骨小梁数量和骨小梁厚度增加，从而增加骨密度，达到促进骨折愈合的作用。

由前期实验[15,16]可推测，刺老苞根皮可能通过促进血管生成，缩短血管重建时间，诱导参与骨折愈合的成纤维细胞、成骨细胞分裂增殖，同时抑制破骨细胞分化，促进骨小梁形成，使骨小梁数量和骨小梁厚度增加，松质骨网状结构趋于完整。结合生物力学参数结果提示，大鼠胫骨骨结构的韧性得到提高，且作用与刺老苞根皮的剂量呈一定相关性。由于近年来民族药物资源的开发受到国内外研究学者的关注，刺老苞根皮作为土家族习用草药，对骨损伤疾病(如骨质疏松、骨折等)有良好的疗效，具有很好的开发前景，但其作用机制尚未明确，有待进一步探究，从而更好的为临床治疗提供理论依据和对民族药物刺老苞根皮的开发进行保护。