神经肽在去卵巢大鼠骨组织中表达差异的实验研究

王双磊 韩燚 谢玮鑫 李展春* 肖洁

1. 上海交通大学医学院附属仁济医院骨关节外科, 上海 200127 2. 上海交通大学医学院附属仁济医院麻醉科, 上海 200127

骨质疏松是威胁绝经后老年女性人群健康的常见病之一。 绝经后的女性, 表现为雌激素下降, 骨代谢加快, 同时伴随骨量丢失和骨强度降低, 机体往往经受轻微的创伤就容易发生骨折, 因此防治绝经后骨质疏松对促进老年女性健康以及提高其生活质量有着重要意义。P物质(substance P, SP), 降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP), 血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)和神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)由背根神经节或交感/副交感神经节合成, 运输到骨和骨膜上的丰富的交感神经和感觉神经末梢, 以密集囊泡的方式储存以及释放。SP, CGRP, VIP和NPY与骨组织中的成骨细胞, 破骨细胞, 骨细胞, 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)上的神经肽受体结合, 对骨组织的生长, 代谢和骨重建发挥调节作用[1-3]。本实验通过检测SP, CGRP, VIP和NPY在去卵巢大鼠和假手术大鼠胫骨干骺端的表达及其与骨密度(bone mineral density, BMD)之间的关系, 探讨神经肽在骨质疏松发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：清洁级(SPF)6月龄雌性未孕Sprague-Dawley大鼠12只, 由上海交通大学医学院附属仁济医院动物实验室提供。

1.1.2实验设备：电子天平；烘箱(上海博讯)；高压灭菌器(SANYA公司)；美国LUNAR 双能X线骨密度仪(DXA)。

1.1.3实验材料：多聚甲醛(碧云天公司)；戊巴比妥钠(碧云天公司)；0.9%氯化钠溶液(上海百特医疗用品有限公司)；青霉素；四肽(抗-SP抗体, 1∶1000, Abcam, Cambridge, USA；抗-CGRP抗体, 1∶400, Abcam, Cambridge, USA；抗-VIP抗体, 1:20, Abcam, Cambridge, USA；抗-NPY抗体, 1∶1000, Abcam, Cambridge, USA)。

1.2 实验方法

1.2.1实验动物分组及模型制备：清洁级(SPF)6月龄雌性未孕SD大鼠12只, 体重290～310 g, 随机分为两组(n=12)：去卵巢组(OVX)和假手术组(Sham)。两组大鼠采用腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg), 去卵巢组大鼠经腰背部双侧切口进入腹腔, 切除双侧卵巢。假手术组：在卵巢附近切除和卵巢重量相等的脂肪。去卵巢组和假手术组大鼠均分开饲养在相同鼠笼, 每日摄食量相当, 饮水不限。术后均予青霉素10万U腹腔注射3 d预防感染。

1.2.2骨密度检测：两组动物术后均饲养12 w, 3%戊巴比妥麻醉后, 四肢展开平卧于双能X线骨密度仪平台上检测骨密度。

1.2.3标本的制备：两组动物术后均饲养12 w, 应用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后, 称重后脱臼法处死大鼠, 取子宫称重(湿重)。收集右侧胫骨干骺端, 剔除软组织后立即投入到4%多聚甲醛中, 室温固定，EDTA脱钙, 酒精梯度脱水, 二甲苯透明, 石蜡包埋。沿着纵轴切5 μm厚的切片，依次脱蜡，水化后，用煮沸的枸橼酸进行抗原修复，PBS(0.01 mol/L,pH7.4)冲洗15 min, 含有3%H2O2的甲醇封闭内源性过氧化物酶活性10 min, 滴加正常的山羊血清封闭液，分别滴加Ⅰ抗4℃过夜，滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗，滴加S-P孵育15 min，DAB显色，Mayer's苏木精复染，常规脱水，封片。

1.2.4观察和显微摄影：在光学显微镜下选取阳性结果区进行拍照(E800, Nikon, Tokyo, Japan)SP, CGRP,VIP和NPY免疫阳性表现为棕色斑片状或束状。用Spot Advanced digital-imaging 系统(Diagnostic Instruments, Inc, Sterling Heights, MI, USA)在放大400倍的显微镜下选择3个视野区进行观察。用Pro Plus(version 5.0.1, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)软件, 以MOD作为量化指标, 对免疫组化阳性表达进行量化。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 体重, 子宫湿重和BMD

造模后12 w, OVX组大鼠体重增加, 与Sham组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；OVX组大鼠子宫湿重, BMD降低, 与Sham组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2 大鼠胫骨干骺端神经肽MOD值

造模后12 w, OVX组大鼠SP、CGRP和VIP的MOD值降低, 与Sham组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；OVX组大鼠NPY的MOD值升高, 与Sham组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表1 造模后12 w, OVX组和Sham组大鼠体重, 子宫湿重和BMD值比较Table 1 Comparison of body weight, uterus weight and BMD of rats from Sham and OVX group

注：与Sham组相比较，*P<0.01

图1 大鼠胫骨干骺端SP、CGRP、VIP和NPY的MOD值与BMD之间的相关关系Fig.1 Relationship between BMD and the MOD of SP, CGRP, VIP and NPY of rats’ tibia metaphysis

表2 造模后12 w, OVX组和Sham组大鼠SP、CGRP、VIP和NPY的MOD值比较Table 2 Comparison of MOD of SP, CGRP, VIP and NPY of rats from Sham and OVX group

注：与Sham组相比较，*P<0.01

2.3 大鼠胫骨干骺端SP、CGRP、VIP和NPY的MOD值与BMD值之间的关系。

造模后12 w, 大鼠SP, VIP的MOD值与BMD值成正相关关系(r=0.746,P=0.005；r=0.591,P=0.043), 大鼠NPY的MOD值与BMD值成负相关关系(r=-0.666,P=0.018)。见图1。

3 讨论

本研究探讨了OVX组大鼠与Sham组大鼠胫骨干骺端SP、CGRP、VIP和NPY的表达。首先通过双侧去卵巢法建立雌激素缺乏的大鼠骨质疏松模型[4]。本研究中, 造模后12 w, OVX组大鼠BMD值(0.230±0.013) g/cm2低于Sham组大鼠BMD值(0.261±0.019) g/cm2, OVX组大鼠体重(450.49±44.42) g大于Sham组大鼠体重(334.39±44.18) g, OVX组大鼠子宫湿重(0.22±0.08) g低于Sham组大鼠子宫湿重(0.67±0.08) g, 差异具有统计学意义。本研究结果与其他类似的研究结果相同, 双侧卵巢切除术后大鼠体重增加, 子宫萎缩, BMD下降[5,6]。研究结果表明, 双侧卵巢切除术后12 w, 大鼠骨质疏松模型建立成功。

本研究表明, 与Sham组相比较, OVX组大鼠SP的MOD值降低, 差异具有统计学意义(P<0.01)。杨锋等[7]研究表明，SP在骨质疏松大鼠骨组织中的表达降低。郑新峰等[5]研究表明, 双侧卵巢切除术后3 w和6 w, 小鼠骨组织SP表达下降。Ding等[2]研究SP含量在OVX小鼠骨折愈合过程中的变化时发现, OVX组小鼠骨折部位SP含量低于对照组。两组大鼠SP的MOD值与BMD值成正相关关系(r=0.746,P=0.005)。SP通过与细胞上的受体结合发挥生理病理作用，其中SP与神经激肽-1(neurokinin-1，NK-1)受体的结合力最大。NK-1受体在大鼠的BMSCs，成骨细胞，骨髓巨噬细胞(bone marrow macrophages, BMMS)，破骨细胞上都有表达。体外实验发现，SP能增加大鼠颅骨成骨细胞矿化小结的形成，SP的这种成骨作用能被NK-1受体拮抗剂所抑制[8]。高浓度的SP能刺激BMSCs的增殖和矿化，低浓度的SP能增加晚期BMSCs的成骨分化。正常大鼠松质骨中的SP浓度表现为低浓度， 本研究中OVX组比Sham组大鼠胫骨干骺端SP表达降低，SP对大鼠骨组织中BMSCs, 成骨细胞的成骨刺激作用减弱，导致成骨活性下降，骨密度降低，SP可能参与了骨质疏松的发生发展[9]。

本研究结果显示, 与Sham组比较, OVX组大鼠CGRP的MOD值降低, 差异具有统计学意义(P<0.01)。CGRP通过提高细胞内转录激活因子-4(activating transcription factor-4,ATF4)和骨钙素(osteocalcin, OC)的表达，刺激成骨细胞的分化；CGRP也能通过影响骨保护蛋白(osteoprotegerin, OPG)/核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)的比值，抑制破骨细胞的生成[10]。BMSCs，成骨细胞，BMMS和破骨细胞都有CGRP受体的表达。CGRP(10-10-10-8mol/L)能刺激BMSCs增殖，上调成骨基因的表达，增加BMSCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和矿化程度。CGRP(10-8mol/L)能抑制BMM中NF-κB对RANKL的激活, 下调破骨基因，抑制BMMS的骨吸收活性[11,12]。这些研究表明，CGRP在体内生理浓度下具有促进骨形成，抑制骨吸收的作用。

NPY是神经系统合成和分泌的一种生物活性物质, 在骨组织中NPY通过与其特异性Y受体结合, 调节成骨细胞和破骨细胞的活性, 从而在骨的生理病理过程中发挥重要作用。骨组织中成骨细胞系细胞上有NPY Y1受体的表达，NPY Y2受体在骨组织中不表达。NPY能抑制BMSCs到成骨细胞系的分化，降低大鼠颅骨成骨细胞分化基因的表达和矿物质的沉积[13]。本研究结果显示, 与Sham组比较, OVX组大鼠NPY的MOD值升高, 差异具有统计学意义(P<0.05)；大鼠NPY的MOD值与BMD值成负相关关系(r=-0.666,P=0.018)。Xiao等[3]在研究绝经后骨质疏松患者和骨性关节炎患者的股骨头松质骨神经肽表达和骨微结构时发现, 相对于骨性关节炎患者, 骨质疏松患者的股骨头松质骨SP, CGRP和VIP表达降低, NPY表达增高。本研究结果发现, 相对于Sham组大鼠, OVX组大鼠表现为SP, CGRP和VIP表达降低, NPY表达增高, 与上述研究结果相符。

神经纤维大多分布于骨组织中代谢活跃的部位。VIP是交感神经分泌的一种神经肽, VIP在骨膜、骨髓腔、血管中都有表达；VIP受体在骨膜、骨髓腔、 血管、成骨细胞、破骨细胞中有表达[14,15]。本研究结果显示, 与Sham组比较, OVX组大鼠VIP的MOD值降低(P<0.01), 大鼠VIP的MOD值与BMD值成正相关关系(r=0.592,P=0.043)。大鼠成骨细胞表面有VIP type 2受体(VPAC2受体), VIP与VPAC2受体结合, 影响成骨细胞RANKL和OPG表达。VIP能通过降低RANKL/OPG的比值抑制破骨细胞的分化, 降低破骨细胞活性和骨吸收功能[14]。

本研究结果中, SP, CGRP和VIP在去卵巢组大鼠骨组织中表达降低, NPY在去卵巢组大鼠骨组织中表达升高, SP, VIP和NPY表达与MOD值之间有相关性, 由此推断神经肽可能参与了去卵巢大鼠骨质疏松的发病机制, 影响这些神经肽的表达可能作为抗骨质疏松治疗的一种方法。但是本研究中只探讨了神经肽在骨组织中的变化, 且样本量较低, 需要全面阐述神经肽在骨质疏松发生发展中的作用, 进一步探讨可能的信号转导机制, 为神经肽在骨质疏松疾病发生发展中提供理论基础。