观察松质骨BMG作为组织工程软骨载体的可行性和有效性

蔡晓阳 徐利民 陈庆煌 赵春安

1. 国立华侨大学医院骨科，福建 泉州 362011 2. 四川省隆昌县人民医院，四川 内江 642150 3. 泉州市福建医科大学第二附属医院骨科，福建 泉州 362011

软骨损伤是全球常见的健康问题，由于供体材料稀缺、容易退变等问题导致软骨修复成为骨科领域的重点难题。随着组织工程的发展，软骨细胞单层培养已经取得了一系列有价值的成果[1,2]。然而，软骨细胞单层培养与体内的软骨结构存在很大不同，其中一个关键的差异为缺乏细胞之间或细胞与细胞外基质之间的生物相容性支架，它为种子细胞的粘附、迁移和分化提供三维物理支持，导致单层培养物中暴露的软骨细胞易于脱分化，丧失其原始基因表达谱和表型，最终在研究软骨病的发病机制和治疗中失去应用价值[3,4]。近年来，不少学者已经在软骨组织工程中开发和测试了许多支架[5,6]，然而截止到目前尚没有发现一种理想的支架。本研究中，我们将高度多孔的松质骨BMG作为组织工程软骨载体，探讨其负载兔关节软骨细胞来进行软骨修复的可行性。

1 材料与方法

1.1 松质骨BMG的制备

根据Wang等[7]报道的一些修改方法制备了BMG。从新鲜安乐死的成年新西兰白兔收获肱骨，去除所有软组织和骨髓，并用无菌去离子水洗涤骨骼。然后将清洁的骨骼在磁力搅拌器中进行以下连续步骤：(1)室温下将骨骼浸置于氯仿-甲醇(1∶1)混合液中过夜以除去脂质；(2)在4 ℃下浸置于0.6 M盐酸中软化12～36 h，得到不同的机械强度骨骼；(3)在4 ℃下用2 M CaCl2洗涤2 h以提取较低分子量的蛋白质多糖；(4)在4 ℃下用0.5 M EDTA洗涤2 h以去除非分散钙和提取蛋白质多糖；(5)在4 ℃下用8 M LiCl洗涤以收缩胶原纤维，并提取高分子量蛋白质多糖；(6)在55 ℃下用去离子水洗涤2 h以提取骨胶的可溶性部分。在每个步骤之间，骨材料用无菌去离子水洗涤。将制备好的BMG切成直径为3 mm的球形，用环氧乙烷灭菌并储存在-80 ℃冰箱中以备使用。

1.2 BMG的表征

制备的BMG在BX51-P光学显微镜(奥林巴斯公司)下拍照观察，并通过s570扫描电子显微镜(HITACHI公司)分析BMG超微结构的表征。

1.3 软骨细胞的分离和培养

无菌环境下从1个月大的新西兰白兔的髋关节、膝关节和肩关节获得关节软骨标本，并置于含有双抗的D-Hank溶液中。将软骨样品切成糊状，在37 ℃环境下依次在0.05%透明质酸酶、0.2%胰蛋白酶和0.2%胶原酶II型中消化10 min、30 min和1 h。然后使用尼龙网过滤器过滤细胞悬浮液，将得到的滤液以65 g离心10 min，去掉上清，将细胞沉淀重新悬浮于改良的Eagle培养基(含30%胎牛血清和双抗)。将软骨细胞(5×105个)接种在25 cm2培养瓶中，在5%CO2、37 ℃环境中培养。培养基每2天更换一次。

1.4 松质骨BMG和软骨细胞复合体的构建

取培养软骨细胞，在0.2%胰蛋白酶中消化10 min，4℃65 g离心10 min，弃上清，取软骨细胞(2×106)重悬于100 μL Eagle培养基中，接种到已经放置在10 mL离心管底部的松质骨BMG上。接种30 min后，将4 mL Eagle培养基小心地加入到软骨细胞-松质骨BMG复合体中。继续培养复合体7 w，培养基每3 天更换一次。

1.5 组织工程软骨的组织学观察

分别在培养第1、4、7 w时获取工程软骨组织(n=5)，用4%多聚甲醛固定，乙醇脱水，用石蜡包埋。切成5 μm的薄片，用苏木精和曙红(HE)进行整体染色，用甲苯胺蓝染色观察蛋白聚糖表达，免疫组化染色观察I型和II型胶原蛋白的表达。随机选取1、4、7 w每个时间点的5个切片，计算出整个组织工程软骨中新形成的软骨组织的百分比。在整个工程组织中新形成的软骨组织的百分比=(新形成的软骨/整体工程组织)×100%。

蛋白聚糖和II型胶原蛋白的表达用Image Pro-Plus 5.1图像分析软件进行半定量分析。随机选取培养1、4、7 w每个时间点的5个切片。扫描和分析每个部分的六个胶原蛋白或蛋白聚糖表达。所得到的灰度值表示扫描场的透射光强度,较高的灰度值表示该部分的色素沉着减少，这表明蛋白聚糖和II型胶原蛋白的表达水平较低。平均灰度值=所有灰度值总和÷总面积。平均灰度值越低，阳性表达水平越强烈。

1.6 数据分析

2 结果

2.1 松质骨BMG的表征

图3 松质骨BMG和软骨细胞复合体构建过程的组织学表现。(a)、(b)、(c)为HE染色，(d)、(e)、(f)为蛋白聚糖甲苯胺蓝染色(紫色表达为阳性)，(g)，(h)，(i)-II型胶原免疫染色(橙色表达为阳性)；(a)、(d)、(g)-1 w，(b)、(e)、(h)-4 w，(c)、(f)、(i)-7 wFig.3 Histological observation of chondrocytes cultured on the cancellous BMG. (a), (b), (c) HE staining; (d), (e), (f) Proteoglycan toluidine blue staining (positive expression was purple); (g), (h), (i) Type II collagen immunostaining (positive expression was orange); (a), (d), (g): At week 1; (b), (e), (h) At week 4; (c), (f), (i) At week 7

制备的松质骨BMG是多孔的，它可以轻易地修剪成不同的尺寸和轮廓，例如3 mm的球形(图1)。扫描电子显微镜下观察到在100～400 μm范围内的松质骨BMG中的通孔(图2 a)，当软骨细胞-松质骨BMG复合体培养24 h后，软骨细胞均牢固地附着在松质骨BMG表面和微孔上，形成互连和集群(图2b)。

图1 松质骨BMG的代表性宏观图像Fig.1 Macroscopic images of the cancellous BMG

2.2 组织学观察结果

培养第1周时，HE染色显示，松质骨BMG周围的软骨细胞数量明显增多，大多数软骨细胞显示出纺锤状形态(图3 a)。甲苯胺蓝和免疫组织化学染色表明，在BMG支架上的接种的软骨细胞产生蛋白聚糖(图3 d)和II型胶原(图3 g)。

培养第4周时，在BMG表面形成软骨组织，较多的软骨细胞在BMG的中心区域生长(图3b)。同时，BMG支架结构中合成的基质对软骨细胞特异性蛋白聚糖(图3e)和II型胶原(图3 h)染色明显增强。

培养第7周时，BMG表面形成的软骨组织的厚度没有明显增加，但软骨细胞在BMG内部明显增殖，软骨组织形成于松质骨BMG的整个孔中(图3c)。软骨细胞富含蛋白聚糖(图3f)和II型胶原(图3i)均匀分布在BMG周围，同时松质骨BMG由于收缩或降解很难辨别。在第1、4、7 w均没有观察到Ⅰ型胶原蛋白表达。

2.3 软骨组织形成和蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达情况

使用Image J分析软骨中新形成的软骨组织的百分比。培养时间为1、4、7 w，新形成的软骨组织百分比分别为(11.43±2.16)%、(27.41±4.42) %和(44.89±6.05) %，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明，随着培养时间的推移，软骨组织的形成显著增加(图4)。

软骨中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白表达的半定量分析显示，培养时间为1、4、7 w，Ⅱ型胶原蛋白的平均灰度值分别为153.62±6.37、135.49±7.05和120.18±5.34，差异有统计学意义(P<0.05)；蛋白聚糖的平均灰度值分别为144.69±4.05、120.37±2.85、101.96±3.52，差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示随着培养时间延长，软骨中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白含量呈显著增加趋势(图5)。

图4 不同培养时间新形成的软骨组织百分比注：与第1周相比，*P<0.05；与第4周相比，#P<0.05Fig.4 Percentage of newly formed cartilaginous tissue at different culture times

图5 松质骨BMG和软骨细胞复合体产生的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的平均灰度值注：与第1周相比，*P<0.05；与第4周相比，#P<0.05Fig.5 Average gray value of proteoglycan and type II collagen produced by chondrocytes on the cancellous BMG

3 讨论

组织工程软骨的成功构建需要合适的支架来促进细胞增殖并维持分化表型。然而到目前为止，尚未发现理想的支架材料。软骨组织工程的理想支架应具备的特性有[8,9]：①显著的低免疫原性和生物相容性；②良好的可降解性，具有可控的降解速率，以匹配新组织再生速度；③高度多孔，以促进气体交换，营养和代谢废物扩散；④具有机械稳定性，以防止由于过早崩溃引起的新软骨组织形成和关节处的外部应力；⑤生产和储存方便。

在本研究中，我们通过用稀盐酸提取骨来去除矿物质，然后用浓缩的CaCl2去除蛋白质和多糖部分，并将LiCl作为变性剂收缩胶原纤维并将胶原转化为不溶性骨明胶制备BMG。通过脱脂、去矿化和去蛋白质多糖的方法制备的BMG，去除了95%的非胶原蛋白，消除BMG内的抗原物质，使其与宿主相比具有较弱的免疫原性的生物相容性。此外，如Zhang[10]等观察到的，BMG制备过程保留了一定量的骨形态发生蛋白和在异位植入试验中仍具有生物活性的其他软骨形成因子。以往的研究表明，BMG可以在体外诱导间充质细胞分化成软骨细胞，并在体内软骨缺陷中形成透明样软骨[11]。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是负责BMG潜在的软骨诱导活性的主要因子。其中，BMP-2和BMP-7等已经获得较大突破，已被广泛应用于软骨组织工程中，可促进软骨细胞增殖，刺激蛋白聚糖和II型胶原蛋白的表达，维持分化状态[12,13]。因此，当细胞在BMG上培养时，埋藏在BMG中的BMP可以通过降解过程暴露和释放，从而促进永久性软骨形成。研究发现，当BMG在体内被植入骨缺损时，在缺损部位招募的间充质干细胞(MSC)将受支架BMG及周围环境的影响。当存在成骨环境，例如足够的血液供应和合适的氧气压力时，软骨细胞将变得肥大并进一步分化成骨细胞[14,15]；当没有成骨环境，如体外组织工程实验时，由于氧气压力相对较低，血液供应不足，松质骨BMG主要作为支架，支持软骨细胞的三维生长，而不促进进一步成骨分化。因此，本研究中没有在松质骨BMG和软骨细胞复合体中观察到I型胶原表达。

BMG已经被构建成一个骨骼软骨替代物，Bergen等[16]将第1代(P1)的原代软骨细胞与皮质BMG组合，结果皮质BMG上产生具有层状层的1.3 mm厚的透明样软骨，但是由于软骨细胞很少渗透到内部区域，导致软骨外壳与皮质BMG的整合较弱，最终使得该组织工程化的软骨帽与基底的BMG支架分离并破碎，分析原因为皮层BMG的孔径范围为15 μm左右，而基于早期研究，根据细胞大小、迁移要求和物质运输需求，支架孔径的最小要求应为100 μm[17]。因此，本研究中使用的松质骨BMG是高度多孔的，内部孔尺寸为100～400 μm，允许软骨细胞生长到每个孔中，随着培养时间的推移，软骨组织的形成显著增加，并且蛋白聚糖和胶原II型遍及松质骨BMG的整个孔。上述结果提示松质骨BMG可以为软骨细胞增殖提供适宜的空间，有利于维持细胞表型，并促进代谢物质的交换。

此外，通过应用不同的脱盐时间和去矿化时间来获得不同生物降解性和机械强度松质骨BMG。研究中，在培养第6周时观察到松质骨BMG的明显收缩或降解，与新软骨组织的形成显著同步。随着这种优异的生物降解性，松质骨BMG可以为软骨细胞增殖和蛋白聚糖及胶原II型沉积提供空间。基于其可调节的机械强度，松质骨BMG可以容易地修剪成所需的形状和尺寸，以适应不同的修复和再生缺陷，从而赋予骨科和牙科外科医生能够根据个体修复需要定制骨软骨移植物。制备后，松质骨BMG可以在低温(-80 ℃)下长时间保存，对其生物活性没有不利影响。

综上所述，松质骨BMG具有良好的生物相容性，可控的机械强度和降解速率，显著的低免疫原性，高可用性和合适的孔隙率，所以是一种较理想的支架材料。